ĐỐI TƢỢNG, NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.3.3.Định lượng protein tan theo phương pháp Lowry [6].
* Nguyên tắc:
Dựa vào cường độ màu xanh của phức chất đồng protein khử hỗn hợp photpho molipden - photpho vonphramat (thuốc thử folingxiocanto) để xác định khối luợng protein. Phức chất màu xanh da trời có độ hấp thụ cực đại ở bước sóng 750nm. Phương pháp Lowry có sự phối hợp giữa phản ứng biure và phản ứng với thuốc thử foling của dung dịch protein. Thuốc thử foling tác dụng với một gốc acid amin trong phân tử protein để tạo nên phức chất màu.
31
Các loại protein có thể tan trong các dung môi khác nhau. Do đó, để việc tách chiết protein đạt hiệu quả triệt để, chúng tôi dùng 3 loại đệm chiết protein tan, đó là: Đệm photphat citrate (pH = 10), đệm NaCl (pH = 7) và đệm nước cất.
+ Hoá chất:
- Dung dịch đệm photphat citrate pH = 10 - Dung dịch đệm NaCl pH = 7
- Dung dịch D (chỉ pha trước khi dùng) gồm:
Dung dịch A: Na2CO3 2% trong NaOH 0,1N Dung dịch B: CuSO4 0,5%
Dung dịch C: Natritartrat 1%
Dung dịch D = 48 ml dung dịch A + 1ml dung dịch B + 1ml dung dịch C.
+ Cách làm:
- Cân 0,05g mẫu đã sấy khô tuyệt đối, nghiền nhỏ cho vào tube, thêm vào 1,5 ml dung dịch chiết, lắc đều trên máy vontex trong thời gian 5 -10 phút. Sau đó cho vào tủ lạnh ở nhiệt độ 40C để qua đêm (24 giờ). Sau 24 giờ đem mẫu ly tâm ở tốc độ 12.000 vòng/phút trong thời gian 30 phút, sau đó thu dịch. Lặp lại 3 lần như trên đối với mỗi loại đệm chiết.
- Tổng dịch chiết thu được đối với mỗi mẫu, với mỗi loại đệm được đem định mức lên 10 ml.
- Dịch chiết thu được đem đo trên máy quang phổ UV - Visible Spectrometer Cintra 40 ở bước sóng 750 nm theo cách sau:
Ống thí nghiệm: 1,25 ml dung dịch D + 0,75 ml nước cất + 0,25 ml mẫu + 0,25 ml foling.
Ống đối chứng: 1,25 ml dung dịch D + 0,75 ml nước cất + 0,25 ml nước cất + 0,25 ml foling.
32
Các ống được lắc đều trong thời gian 60-90 phút khi màu phản ứng chuyển từ màu vàng sang màu xanh và đạt đến cường độ màu cực đại thì được đem đo trên máy. Kết quả trên máy quang phổ xác định được mật độ quang hấp thụ. Sau khi đối chiếu với đồ thị chuẩn ta sẽ được lượng protein tan trong 1ml dung dịch mẫu thí nghiệm (mg/ml).
+ Tính kết quả:
Hàm lượng protein được tính theo công thức: Hàm lượng protein =
g axp
x100%. Trong đó:
a: Số đo trên máy quang phổ p: Hệ số pha loãng.
g: Khối lượng mẫu phân tích (mg).