4. Ý nghĩa của đề tài
2.2.1.1. Thu thập mẫu
Lấy các cành, lá cây mục, rơm rạ mục, đất mùn và rác thải ở những nơi khô ráo, mỗi loại mẫu lấy khoảng 20 gam mỗi lần, tiến hành lấy ở các vùng khác nhau. Mẫu sau khi lấy về sẽ được cho vào túi nilon rồi đánh dấu và ghi đầy đủ thông tin, thời gian và địa điểm mẫu được lấy.
2.2.1.2. Chuẩn bị môi trưởng phân lập và bảo quản
Khi tiến hành phân lập thì điều kiện đầu tiên là khử trùng thiết bị và dụng cụ thí nghiệm. Sau khi vô trùng các dụng cụ xong tiến hành cân đo môi trường, cụ thể là môi trường Czapek-Dox cơ sở để làm môi trường phân lập, môi trường được hấp thanh trùng ở 1210
C trong 45 phút sau đó phân phối khoảng 25 ml môi trường vào hộp lồng đã vô trùng. Để có môi trường thạch nghiêng giữ giống thì ta rót khoảng 3 - 4 ml môi trường (chưa thanh trùng) vào ống nghiệm, đậy nút bông rồi đem thanh trùng. Sau đó đặt nghiêng ống nghiệm chứa môi trường khi còn đang nóng.
2.2.1.3. Hoạt hoá vi sinh vật
Lấy 10 ống nghiệm, nhỏ vào mỗi ống 9 ml nước cất. Cân 1 gam mỗi mẫu đem tán nhỏ rồi cho vào ống nghiệm đầu tiên lắc thật đều. Dùng pipet hút 1 ml dung dịch mẫu đó nhỏ vào ống nghiệm thứ 2 lắc đều, sau đó dùng pipet hút 1 ml dung dịch ở ống thứ 2 nhỏ vào ống thứ 3. Cứ làm như vậy cho tới ống thứ 10.
Dùng pipet hút 1 ml dung dịch mẫu ở từng ống nghiệm nhỏ vào hộp lồng tương ứng đã chứa môi trường phân lập, lấy que trang trang đều, làm như vậy cho tới hộp lồng thứ 10. Cứ làm lần lượt như vậy đối với từng mẫu. Sau khi chang mẫu vào các hộp lồng xong đánh dấu rồi gói cẩn thận lại đem nuôi trong tủ ấm khoảng 300
SVTH: Nguyễn Thị Dung 29 K35B – SP Sinh
Thường xuyên kiểm tra các hộp lồng mỗi ngày. Nếu thấy có khuẩn lạc mới mọc lên thì cấy chủng đó sang môi trường thạch nghiêng rồi đánh dấu cho vào tủ ấm để nuôi, theo dõi 3 – 4 ngày. Đối với những chủng không lên thì loại bỏ, chủng nào lên thì giữ lại, bảo quản trong tủ lạnh ở 0 – 40C để giữ giống dùng cho việc nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2. Phương pháp hoá sinh
2.2.2.1. Nuôi cấy chủng nấm mốc để thử hoạt tính
Các chủng nấm tuyển chọn được nuôi cấy trải dày trên môi trường giữ giống trong đĩa petri, nuôi trong tủ ấm từ 36 đến 48 giờ.
Xác định hoạt tính enzyme bằng phương pháp cấy chấm điểm
Định tính cellulase bằng phương pháp cấy chấm điểm. Dùng que cấy lấy một ít chủng nuôi cấy trong môi trường thạch nghiêng. Sau đó cấy chấm một điểm vào môi trường thạch đĩa chứa 1% cơ chất CMC, môi trường tủ ấm 3 đến 4 ngày. Hiện hình vòng phân giải bằng thuốc thử liugon đỏ 1 %. Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số (D-d) cm.
Trong đó D: là đường kính vòng phân giải d: là đường kính khuẩn lạc.
Xác đinh hoạt tính enzyme bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983)
Dùng khoan nút chai khoan một lỗ trên môi trường thử hoạt tính. Nhỏ vào mỗi lỗ khoan một ml dung dịch enzyme đã chuẩn bị sẵn, để tủ lạnh 6-8 giờ cho enzyme khuếch tán vào môi trường thạch, sau đó cho vào tủ ấm 300
C trong 24 giờ. Hiện hình vòng phân giải bằng thuốc thử liugon đỏ 1%. Hoạt tính enzyme được xác định bằng hiệu số (D-d) cm.
Trong đó D: là đường kính vòng phân giải d: là đường kính lỗ đục.
SVTH: Nguyễn Thị Dung 30 K35B – SP Sinh
Nghiên cứu ảnh hưởng của yếu tố môi trường đến hoạt tính của cellulase
Ảnh hưởng của nhiệt độ lên hoạt tính của cellulase
Cho dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các nhiệt độ khác nhau từ 25 đến 400C trong 30 giờ. Hoạt tính cellulase của các dung dịch được xác định theo phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy
Cho dung dịch cellulase và dung dịch 1% CMC phản ứng với nhau ở các mức thời gian khác nhau từ 12 đến 48 giờ. Sau khoảng thời gian 12 giờ, xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
Ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên
Nguồn cacbon lần lượt được sử dụng là vỏ trấu, lõi ngô, vỏ lạc, nuôi cấy chủng trong thời gian 36 giờ, sau đó lấy dịch enzyme xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán môi trường thạch.
Ảnh hưởng của nguồn nitơ
Nuôi cấy các chủng tuyển chọn trên môi trường Czapek-Dox thích hợp với nguồn nitơ được sử dụng lần lượt là: NaNO3, NH4Cl, (NH4)2SO4, pepton trong thời gian là 36 giờ. Sau đó lấy dịch enzyme xác định hoạt tính cellulase bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch.
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính carboxymethylcellulase
Dựa theo phương pháp của Miller. Nguyên lý
CMC-ase phân cắt cacboxymethylcellulose (CMC) và amylase phân cắt tinh bột thành các oligosacaride và glucose có tính khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.
SVTH: Nguyễn Thị Dung 31 K35B – SP Sinh
Tiến hành thí nghiệm
Pha dung dịch gốc 10 µmol/ml D-glucose trong đệm 50 mM Na-acetate. Từ đó pha loãng thành các nồng độ 0; 2; 4; 6; 8; 10 (µmol/ml). Lấy 50 µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450 µl dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750 µl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540nm .
Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel thể hiện ở phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-glucose và giá trị OD540nm là
y = 18,582x+0,261.
Trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch x là giá trị OD540nm tương ứng
Hệ số tương quan R2 = 0,9876 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
Xác định hoạt tính của CMCase
Cân 1 gram mẫu thí nghiệm, pha loãng 10 ml nước cất, lắc đều, lọc dịch lọc thu được mẫu cần kiểm tra. Sau đó lấy 450 µl dung dịch 0,5% CMC + 50 µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 50oC trong 30 phút, sau đó bổ sung 750 µl dung dịch DNS để dừng phản ứng.
Mẫu đối chứng: 50 µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp + 750 µl dung dịch DNS làm bất hoạt enzyme + 450 µl dung dịch 0,5% CMC , ủ ở 50oC trong 30 phút.
Đun cách thuỷ mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5 phút, cho qua nước lạnh. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540nm. Từ giá trị OD ta tính được lượng
đường khử được tạo ra nhờ đường chuẩn theo phương trình
SVTH: Nguyễn Thị Dung 32 K35B – SP Sinh
Trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch x là giá trị OD540nm tương ứng.
Từ kết quả thí nghiệm ta tính được IU/gam cơ chất khô [19].
2.2.2.3. Phương pháp xác định protein tổng số
Dựa theo phương pháp của Bradford (1976). Nguyên lý
Phương pháp dựa trên sự bắt màu của protein khi có mặt của dịch nhuộm Bradford (thành phần chính là Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB- 250)) có tính bám đặc hiệu đối với các amino acid trên bề mặt các phân tử protein cần phân tích. Các phân tử thuốc thử có chứa 6 nhóm phenyl và 2 nhóm acid sulfunic. Do đó các tương tác chủ yếu xảy ra đối với các đuôi kị nước (tryptophan, tyrosine, histidine và phenylalanine), tích điện âm (arginine, lysine) và là các liên kết yếu hoặc không đồng hoá trị.
Tiến hành thí nghiệm
Dựng đường chuẩn BSA, chuẩn bị dung dịch BSA hàm lượng 0,5 mg/ml bằng cách pha loãng 2 lần dung dịch mẹ đã chuẩn bị với H2O siêu sạch. Tiến hành xây dựng đường chuẩn kết quả thể thu được phương trình đường chuẩn
y = 22,786x-0,3047
Trong đó: y là lượng BSA có trong 1ml dịch x là giá trị OD595nm tương ứng
Hệ số tương quan R2 = 0,9928 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ.
Cân 1 gram mẫu thí nghiệm, pha loãng 10 ml nước cất, lắc đều, lọc dịch lọc thu được mẫu cần kiểm tra. Xác định protein tổng số, tiến hành thí nghiệm bằng cách lấy 800 µl dung dịch protein cần kiểm tra (đã pha loãng phù hợp) và bổ sung thêm 200 µl thuốc thử Bradford. Ủ trong 15-20 phút ở điều kiện phòng, đo độ hấp phụ ở A595nm. Xác định hàm lượng protein theo phương
SVTH: Nguyễn Thị Dung 33 K35B – SP Sinh
trình thu được y = 22,786x-0,3047 trong đó y là lượng BSA có trong 1 ml dịch, x là giá trị OD595nm tương ứng.
Từ kết quả phân tích ta tính ra được lượng protein tổng số/ gam mẫu [22].
2.2.2.4. Phương pháp xác định lượng đường tổng số
Phương pháp phenol-acid-sulfuric của Michel và Cs Nguyên lý
Các loại đường đơn, oligosaccharide và dẫn xuất của chúng (bao gồm cả các ether methyl) không hoặc có các nhóm có tính khử, sẽ tạo ra màu vàng cam khi xử lý bằng phenol và H2SO4 đặc. Phản ứng này rất nhạy cảm và màu sắc bền.
Tiến hành thí nghiêm
Dung dịch gốc 10 µmol/ml D-xylose, sau đó pha loãng thành các nồng độ 0,2 đến 2,0 µmol/ml. Lấy 0,5 ml mỗi nồng độ D-xylose, sau đó bổ sung lần lượt 0,5 ml dung dịch 5% phenol, 2,5 ml H2SO4 đậm đặc. Trộn đều và giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Đo ở A490nm thu được các giá trị OD tương ứng. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ D-xylose với giá trị OD được xây dựng Phương trình thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ D-xylose và giá trị OD490nm là y = 2,4881x+0,0016.
Trong đó: y là lượng D-xylose trong 1ml dịch x là giá trị OD490nm tương ứng
Hệ số tương quan R2
= 0,9984 chứng tỏ mối quan hệ giữa x và y là rất chặt chẽ.
Xác định hàm lượng đường tổng số, mẫu thí nghiệm được chiết và li tâm thu dịch trong. Tiến hành phản ứng tương tự như trên với bước 2 được thay thế bằng mẫu thí nghiệm có độ pha loãng phù hợp. Lượng đường tổng số được xác định theo phương trình y = 2,4881x+0,0016
Trong đó y là lượng D-xylose trong 1 ml dịch, x là giá trị OD490nm tương ứng [23].
SVTH: Nguyễn Thị Dung 34 K35B – SP Sinh 2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu
Thí nghiệm được tiến hành nhiều lần lặp lại, sau đó sử dụng phương pháp trung bình cộng để tìm giá trị trung bình của các kết quả của các lần thí nghiệm nhắc lại. Kết quả trung bình cộng thu được có độ chính xác cao hơn. Do đây là các thí nghiệm đơn nên không cần phương sai.
SVTH: Nguyễn Thị Dung 35 K35B – SP Sinh
CHƢƠNG 3:
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát khả năng sinh cellulase của chủng M4V trên các phế phụ phẩm nông nghiệp phẩm nông nghiệp
Nguồn cacbon có ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối và sinh enzyme của nấm. Nó có vai trò như một chất kích thích nấm sinh tổng hợp cellulase. Do đó, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm M4V.
Chủng M4V được nuôi cấy trong môi trường rắn thích hợp với nguồn cacbon lần lượt là vỏ trấu, vỏ lạc, vỏ ngô, sử dụng nguồn dinh dưỡng khoáng là môi trường Czapek- Dox thích hợp trong thời gian 4 ngày, sau đó lấy dịch nuôi cấy đem li tâm, loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983). Kết quả được trình bày ở hình và bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1. Khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V trên các nguồn cơ chất khác nhau
Nguồn cơ chất Khả năng sinh cellulase D-d (cm)
Vỏ trấu 2.5
Vỏ lạc 2.2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 36 K35B – SP Sinh
Vỏ trấu Vỏ lạc
Lõi ngô
Hình 3.1. Hoạt tính của chủng M4V trên nguồn cơ chất vỏ trấu, vỏ lạc và lõi ngô
Kết quả nghiên cứu ở hình và bảng 3.1 cho thấy, chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase cao trên các phế phụ phẩm nông nghiệp. Trong đó, vỏ trấu là cơ chất thích hợp để sinh cellulase từ chủng nấm mốc M4V. Kết quả này cũng giống như các kết quả nghiên cứu trước đây, các chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh trong các môi trường có nguồn cacbon tự nhiên, các chất phế phụ phẩm mà chúng tôi sử dụng thường có nhiều chất xơ, thường bị bỏ hoặc có thể làm chất đốt [7], [8]. Như vậy nếu sử dụng chủng nấm mốc
SVTH: Nguyễn Thị Dung 37 K35B – SP Sinh
M4V có thể nâng cao chất lượng của các phế phụ phẩm nông nghiệp đồng thời tận dụng được các phế phụ phẩm này để sản xuất enzyme sẽ nâng cao được giá trị của các phế phụ phẩm nông nghiệp.
3.2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng đến khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V
3.2.1. Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V
Do các loại phế phụ phẩm nông nghiệp có hàm lượng khoáng khác nhau và mỗi loại có những ưu điểm riêng như lõi ngô thì có độ xốp cao, vỏ lạc và vỏ trấu có mùi thơm. Với những ưu điểm và sự khác nhau đó, để nâng cao chất lượng của nguồn cơ chất chúng tối tiến hành phối trộn các phế phụ phẩm theo nhiều tỉ lệ khác nhau. Dựa vào những nghiên cứu trước đây chúng tối tiến hành nuôi cấy chủng nấm mốc M4V trong môi trường rắn thích hợp với nguồn cacbon phối trộn vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô theo các tỉ lệ khác nhau lần lượt là 4:3:3, 4:4:2, 6:2:2, 6:3:1. Sử dụng nguồn dinh dưỡng khoáng là môi trường Czapek- Dox thích hợp trong thời gian 4 ngày, sau đó lấy dịch nuôi cấy, đem li tâm loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983). Kết quả thể hiện ở bảng 3.2.
SVTH: Nguyễn Thị Dung 38 K35B – SP Sinh
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V
Nguồn cacbon Hoạt tính cellulase của chủng M4V (D-d) cm
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 4:3:3
2.8
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 4:4:2
3.0
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 6:2:2
1.4
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 6:3:1
1.8
Tỉ lệ 4:4:2 Tỉ lệ 4:3:3
Hình 3.2. Hoạt tính của chủng M4V ở tỉ lệ phối trộn 4:4:2 và 4:3:3
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy nguồn cơ chất được phối trộn theo tỉ lệ 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) cho hoạt tính mạnh nhất với đường kính phân
SVTH: Nguyễn Thị Dung 39 K35B – SP Sinh
giải (D-d) – 3,0 cm. Do đó chúng tôi chọn tỉ lệ này để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Như vậy, chủng M4V có thể sinh cellulase với hoạt tính cao trên các cơ chất phế phụ phẩm nông nghiệp, đây chính là nguồn nguyên liệu chứa cellulase rẻ tiền, dễ kiếm ở hầu hết các vùng nông thôn của Việt Nam.
3.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V
Từ nghiên cứu về ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp chúng tôi đã tìm ra được tỉ lệ phối trộn thích hợp nhất cho sự sinh cellulase của chủng M4V là 4 vỏ trấu : 4 vỏ lạc : 2 lõi ngô. Để thu được lượng cellulase nhiều hơn và ổn định hơn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men của chủng M4V trên cơ chất vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô theo tỉ lệ 4: 4: 2.
3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase
Thời gian lên men bề mặt của nấm mốc khoảng 36-60 giờ. Tuỳ thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian tạo ra enzyme ở các thời