4. Ý nghĩa của đề tài
2.2.2.4.Phương pháp xác định lượng đường tổng số
Phương pháp phenol-acid-sulfuric của Michel và Cs Nguyên lý
Các loại đường đơn, oligosaccharide và dẫn xuất của chúng (bao gồm cả các ether methyl) không hoặc có các nhóm có tính khử, sẽ tạo ra màu vàng cam khi xử lý bằng phenol và H2SO4 đặc. Phản ứng này rất nhạy cảm và màu sắc bền.
Tiến hành thí nghiêm
Dung dịch gốc 10 µmol/ml D-xylose, sau đó pha loãng thành các nồng độ 0,2 đến 2,0 µmol/ml. Lấy 0,5 ml mỗi nồng độ D-xylose, sau đó bổ sung lần lượt 0,5 ml dung dịch 5% phenol, 2,5 ml H2SO4 đậm đặc. Trộn đều và giữ ở nhiệt độ phòng trong 20 phút. Đo ở A490nm thu được các giá trị OD tương ứng. Đường chuẩn thể hiện mối tương quan giữa nồng độ D-xylose với giá trị OD được xây dựng Phương trình thể hiện mối liên hệ giữa nồng độ D-xylose và giá trị OD490nm là y = 2,4881x+0,0016.
Trong đó: y là lượng D-xylose trong 1ml dịch x là giá trị OD490nm tương ứng
Hệ số tương quan R2
= 0,9984 chứng tỏ mối quan hệ giữa x và y là rất chặt chẽ.
Xác định hàm lượng đường tổng số, mẫu thí nghiệm được chiết và li tâm thu dịch trong. Tiến hành phản ứng tương tự như trên với bước 2 được thay thế bằng mẫu thí nghiệm có độ pha loãng phù hợp. Lượng đường tổng số được xác định theo phương trình y = 2,4881x+0,0016
Trong đó y là lượng D-xylose trong 1 ml dịch, x là giá trị OD490nm tương ứng [23].
SVTH: Nguyễn Thị Dung 34 K35B – SP Sinh 2.2.3. Phương pháp xử lí số liệu
Thí nghiệm được tiến hành nhiều lần lặp lại, sau đó sử dụng phương pháp trung bình cộng để tìm giá trị trung bình của các kết quả của các lần thí nghiệm nhắc lại. Kết quả trung bình cộng thu được có độ chính xác cao hơn. Do đây là các thí nghiệm đơn nên không cần phương sai.
SVTH: Nguyễn Thị Dung 35 K35B – SP Sinh
CHƢƠNG 3:
KẾT QUẢ THẢO LUẬN
3.1. Khảo sát khả năng sinh cellulase của chủng M4V trên các phế phụ phẩm nông nghiệp phẩm nông nghiệp
Nguồn cacbon có ảnh hưởng đến khả năng tạo sinh khối và sinh enzyme của nấm. Nó có vai trò như một chất kích thích nấm sinh tổng hợp cellulase. Do đó, tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn cellulose tự nhiên đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm M4V.
Chủng M4V được nuôi cấy trong môi trường rắn thích hợp với nguồn cacbon lần lượt là vỏ trấu, vỏ lạc, vỏ ngô, sử dụng nguồn dinh dưỡng khoáng là môi trường Czapek- Dox thích hợp trong thời gian 4 ngày, sau đó lấy dịch nuôi cấy đem li tâm, loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983). Kết quả được trình bày ở hình và bảng 3.1 sau:
Bảng 3.1. Khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V trên các nguồn cơ chất khác nhau
Nguồn cơ chất Khả năng sinh cellulase D-d (cm)
Vỏ trấu 2.5
Vỏ lạc 2.2
SVTH: Nguyễn Thị Dung 36 K35B – SP Sinh
Vỏ trấu Vỏ lạc
Lõi ngô
Hình 3.1. Hoạt tính của chủng M4V trên nguồn cơ chất vỏ trấu, vỏ lạc và lõi ngô
Kết quả nghiên cứu ở hình và bảng 3.1 cho thấy, chủng nấm mốc M4V có khả năng sinh cellulase cao trên các phế phụ phẩm nông nghiệp. Trong đó, vỏ trấu là cơ chất thích hợp để sinh cellulase từ chủng nấm mốc M4V. Kết quả này cũng giống như các kết quả nghiên cứu trước đây, các chủng nấm sợi sinh tổng hợp cellulase mạnh trong các môi trường có nguồn cacbon tự nhiên, các chất phế phụ phẩm mà chúng tôi sử dụng thường có nhiều chất xơ, thường bị bỏ hoặc có thể làm chất đốt [7], [8]. Như vậy nếu sử dụng chủng nấm mốc
SVTH: Nguyễn Thị Dung 37 K35B – SP Sinh
M4V có thể nâng cao chất lượng của các phế phụ phẩm nông nghiệp đồng thời tận dụng được các phế phụ phẩm này để sản xuất enzyme sẽ nâng cao được giá trị của các phế phụ phẩm nông nghiệp.
3.2. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy ảnh hƣởng đến khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V
3.2.1. Ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V
Do các loại phế phụ phẩm nông nghiệp có hàm lượng khoáng khác nhau và mỗi loại có những ưu điểm riêng như lõi ngô thì có độ xốp cao, vỏ lạc và vỏ trấu có mùi thơm. Với những ưu điểm và sự khác nhau đó, để nâng cao chất lượng của nguồn cơ chất chúng tối tiến hành phối trộn các phế phụ phẩm theo nhiều tỉ lệ khác nhau. Dựa vào những nghiên cứu trước đây chúng tối tiến hành nuôi cấy chủng nấm mốc M4V trong môi trường rắn thích hợp với nguồn cacbon phối trộn vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô theo các tỉ lệ khác nhau lần lượt là 4:3:3, 4:4:2, 6:2:2, 6:3:1. Sử dụng nguồn dinh dưỡng khoáng là môi trường Czapek- Dox thích hợp trong thời gian 4 ngày, sau đó lấy dịch nuôi cấy, đem li tâm loại bỏ sinh khối. Xác định hoạt tính cellulase trong dịch nuôi bằng phương pháp khuếch tán trên môi trường thạch (William, 1983). Kết quả thể hiện ở bảng 3.2.
SVTH: Nguyễn Thị Dung 38 K35B – SP Sinh
Bảng 3.2. Ảnh hƣởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc M4V
Nguồn cacbon Hoạt tính cellulase của chủng M4V (D-d) cm
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 4:3:3
2.8
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 4:4:2
3.0
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 6:2:2
1.4
Tỉ lệ: vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô 6:3:1
1.8
Tỉ lệ 4:4:2 Tỉ lệ 4:3:3
Hình 3.2. Hoạt tính của chủng M4V ở tỉ lệ phối trộn 4:4:2 và 4:3:3
Kết quả nghiên cứu trên cho thấy nguồn cơ chất được phối trộn theo tỉ lệ 4:4:2 (vỏ trấu: vỏ lạc: lõi ngô) cho hoạt tính mạnh nhất với đường kính phân
SVTH: Nguyễn Thị Dung 39 K35B – SP Sinh
giải (D-d) – 3,0 cm. Do đó chúng tôi chọn tỉ lệ này để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Như vậy, chủng M4V có thể sinh cellulase với hoạt tính cao trên các cơ chất phế phụ phẩm nông nghiệp, đây chính là nguồn nguyên liệu chứa cellulase rẻ tiền, dễ kiếm ở hầu hết các vùng nông thôn của Việt Nam.
3.2.2. Ảnh hưởng của các điều kiện môi trường đến khả năng sinh cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V cellulase trên các phế phụ phẩm nông nghiệp của chủng M4V
Từ nghiên cứu về ảnh hưởng của sự phối trộn các phế phụ phẩm nông nghiệp chúng tôi đã tìm ra được tỉ lệ phối trộn thích hợp nhất cho sự sinh cellulase của chủng M4V là 4 vỏ trấu : 4 vỏ lạc : 2 lõi ngô. Để thu được lượng cellulase nhiều hơn và ổn định hơn, chúng tôi đã tiến hành nghiên cứu các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng lên men của chủng M4V trên cơ chất vỏ trấu : vỏ lạc : lõi ngô theo tỉ lệ 4: 4: 2.
3.2.2.1. Ảnh hưởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase
Thời gian lên men bề mặt của nấm mốc khoảng 36-60 giờ. Tuỳ thuộc vào đặc tính sinh lí của từng giống mốc, thời gian tạo ra enzyme ở các thời điểm khác nhau. Để xác định thời gian tạo ra lượng enzyme cellulase nhiều nhất từ chủng M4V chúng tôi xác định hoạt tính cellulase tại các thời điểm lên men. Kết quả được xác định như sau:
Bảng 3.3. Ảnh hƣởng của thời gian nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase
Chủng VSV Hoạt tính cellulase (D-d) cm
12 giờ 24 giờ 36 giờ 48 giờ
M4V 0.9 1.7 2.3 1.4
SVTH: Nguyễn Thị Dung 40 K35B – SP Sinh
36 giờ 48 giờ
Hình 3.3. Hoạt tính của chủng M4V ở thời gian lần lượt là 36 giờ và 48 giờ
Qua bảng số liệu ở bảng cho thấy thời gian ảnh hưởng đến khả năng sinh cellulase của chủng M4V. Thời gian tạo ra enzyme nhiều nhất là 36 giờ. Nếu kéo dài thời gian lên 48 giờ thì hoạt tính enzyme giảm ứng với thời điểm xuất hiện bào tử. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với công bố của các tác giả như Võ Thị Hạnh và Cs, Lương Đức Phẩm khi lên men bề mặt chủng mốc Asp. Awamori để sản xuất enzyme nhiều nhất vào thời điểm khoảng 36 – 40 giờ [7], [13].
3.2.2.2. Ảnh hưởng của nhiệt độ nuôi cấy đến khả năng sinh cellulase
Chúng tôi tiến hành nghiên cứu ảnh hưởng của nhiệt độ ban đầu đến khả năng sinh cellulase của chủng M4V ở các điều kiện nhiệt độ khác nhau. Sau 36 giờ lên men, xác định hoạt tính của enzyme cellulase. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 sau:
Bảng 3.4. Ảnh hƣởng của nhiệt độ đến khả năng sinh cellulase
Chủng VSV
Hoạt tính cellulase (D-d) cm
260C 320C 380C 440C 500C
SVTH: Nguyễn Thị Dung 41 K35B – SP Sinh
Nhiệt độ 320C Nhiệt độ 440C
Hình 3.4. Hoạt tính của chủng M4V ở 320C và 440C
Kết quả nghiên cứu cho thấy ở nhiệt độ từ 30-350
C khả năng sinh cellulase khá ổn định. Tuy nhiên ở điều kiện nhiệt độ 320
C thì khả năng sinh cellulase là cao nhất với đường kính phân giải đạt 2,8 cm. Khi nhiệt độ quá cao hoặc quá thấp đều ảnh hưởng đến khả năng lên men rắn của chủng nấm mốc M4V. Kết quả nghiên cứu này cũng phù hợp với các công bố khác như Lê Hồng Mai (1989), Lê Thị Hồng Nga (2005) cho rằng nấm mốc có khả năng sinh trưởng và phát triển tốt nhất ở dải nhiệt từ 30 – 350C và ở dải nhiệt này chúng cũng cho sinh khối và enzyme lớn nhất [11], [12].
3.2.2.3. Ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase
Để phân giải polysaccarit khó bền vững như cellulose, vi sinh vật cần phải tạo ra một lượng lớn enzyme cellulase, do đó chúng cần một lượng lớn nitơ, thậm chí có nhiều chủng nấm mốc có thể cần tới 60% nitơ tổng số cho việc sản xuất enzyme ngoại bào. Do đó, để thu được một lượng cellulase lớn
SVTH: Nguyễn Thị Dung 42 K35B – SP Sinh
từ chủng M4V chúng tôi tiếp tục nghiên cứu ảnh hưởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase của chủng nấm mốc này. Với cơ chất được phối trộn theo tỉ lên 4 vỏ trấu : 4 vỏ lạc : 2 lõi ngô, nguồn khoáng cơ chất có sự thay đổi nguồn nitơ. Sau 36 giờ lên men chủng M4V ở 320C chúng tôi tiến hành thử hoạt tính cellulase. Kết quả thu được được thể hiện ở bảng sau.
Bảng 3.5. Ảnh hƣởng của nguồn nitơ đến khả năng sinh cellulase
Chủng VSV Hoạt tính cellulase (D-d) cm
Pepton NaNO3 (NH4)2SO4 NH4Cl
M4V 2.2 2.0 1.7 1.8
Pepton NaNO3
Hình 3.5. Hoạt tính của chủng M4V ở nguồn nitơ pepton và NaNO3
Kết quả cho thấy khả năng sinh cellulase của chủng M4V đã sử dụng đa dạng nguồn nitơ. Nguồn nitơ vô cơ có các gốc nitrat NaNO3 có hoạt tính cellulase cao hơn so với NH4Cl; (NH4)2SO4. Kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng phù hợp với nghiên cứu của Lương Đức Phẩm cho rằng nitrat là nguồn nitơ thích hợp để tổng hợp các enzyme ngoại bào ở nhiều loài nấm của
SVTH: Nguyễn Thị Dung 43 K35B – SP Sinh
chi Aspergillus; Fusarium; Trichoderma [13]. Trên các nguồn nitơ hữu cơ pepton cho hoạt tính cellulase cao hơn. Tuy nhiên, trong quá trình sản xuất chế phẩm enzyme phục vụ cho chăn nuôi thì việc sử dụng nitơ hữu cơ với chi phí cao sẽ dẫn tới kém hiệu quả kinh tế, vì giá thành sản xuất chế phẩm cao.
Như vậy, có rất nhiều yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp cellulase của chủng nấm mốc M4V. Sau khi tiến hành nghiên cứu chúng tôi đã tìm ra được một điều kiện nuôi cấy tốt nhất cho quá trình sinh tống hợp cellulase của chủng nấm mốc M4V như sau: Nguồn cơ chất thích hợp là vỏ trấu và sự phối trộn nguồn cellulose tự nhiên theo tỉ lệ 4 vỏ trấu : 4 vỏ lạc : 2 lõi ngô là tốt nhất cho sự sinh trưởng và tổng hợp enzyme cellulase của chủng nấm mốc M4V; Nhiệt độ thích hợp là 320C; Thời gian lên men rắn là 36 giờ và nguồn nitơ hữu cơ thích hợp nhất cho quá trình lên men là pepton.
3.3. Nâng cao chất lƣợng phế phụ phẩm nông nghiệp thông qua sử dụng chủng nấm mốc M4V để ứng dụng trong chăn nuôi
3.3.1. Kiểm tra hàm lượng đường tổng số của môi trường trước và sau khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V lên men bằng chủng nấm mốc M4V
Với một đất nước nông nghiệp như Việt Nam thì những sản phẩm như vỏ trấu, vỏ lạc và lõi ngô là những vật phẩm có khối lượng rất lớn nhưng lại không có giá trị cao đối với đời sống con người cũng như đối với ngành chăn nuôi. Đây là một sự lãng phí vô cùng nếu chúng ta không tìm được ra một biện pháp xử lí nào đó, biến những nguồn nguyên liệu không có giá trị sử dụng này thành nguồn nguyên liệu có giá trị cao, hay nói cách khác là chúng ta phải nâng cao được chất lượng của các phế phụ phẩm nông nghiệp này bằng cách nâng cao giá trị dinh dưỡng của chúng.
SVTH: Nguyễn Thị Dung 44 K35B – SP Sinh
Để nâng cao được chất lượng của phế phụ phẩm, tôi đã tiến hành nghiên cứu theo con đường sử dụng chủng nấm mốc M4V. Bằng phương pháp lên men rắn trong những điều kiện lên men tối ưu của chủng M4V: thời gian lên men là 36 giờ, nhiệt độ là 320C, độ ẩm là 70%, nguồn nitơ là NaNO3 trên các nguồn cacbon khác nhau là vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô và sự phối trộn các phế phụ phẩm theo tỉ lệ 4 vỏ trấu : 4 vỏ lạc : 2 lõi ngô; 4 vỏ trấu : 3 vỏ lạc : 3 lõi ngô.
Sau khi tiến hành lên men trong những điều kiện thích hợp, tôi tiến hành phân tích hàm lượng đường tổng số trong môi trường lên men. Kết quả này được đem so sánh với những giá trị tương ứng của môi trường trước khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V. Toàn bộ quá trình thí nghiệm phân tích này được tiến hành tại phòng thí nghiệm viện Công nghệ Thực phẩm Hà Nội. Dưới đây tôi xin trình bày kết quả phân tích thu được trong bảng 3.6
Bảng 3.6. Hàm lƣợng đƣờng tổng số của các mẫu cơ chất trƣớc và sau khi lên men
Mẫu trước lên men Hàm lượng đường tổng số (mg/g) Mẫu sau lên men Hàm lượng đường tổng số (mg/g) Vỏ lạc 1,20 Vỏ lạc 2,4
Lõi ngô 3,23 Lõi ngô 5,23
Vỏ trấu 2,16 Vỏ trấu 2,2
4: 3: 3 2,17 4: 3: 3 2,0
4:4:2 1,29 4:4:2 3,2
Như vậy, qua kết quả phân tích được thể hiện trong bảng 3.6 ta nhận thấy hàm lượng đường tổng số trong các nguồn cơ chất đơn khác nhau và trong
SVTH: Nguyễn Thị Dung 45 K35B – SP Sinh
nguồn cacbon có sự phối trộn các phế phụ phẩm theo tỉ lên khác nhau sau khi lên men có sự tăng lên rõ rệt so với trước khi lên men. Nói cách khác, hàm lượng chất khoáng trong cơ chất đã tăng lên thông qua sử dụng phương pháp lên men rắn bằng chủng nấm mốc M4V.
3.3.2. Kiểm tra hàm lượng protein của môi trường trước và sau khi lên men bằng chủng nấm mốc M4V bằng chủng nấm mốc M4V
Mẫu lên men được tiến hành phân tích hàm lượng protein tổng số dựa trên phương pháp của Bradford (1976). Quá trình này cũng được tiến hành tại phòng thí nghiệm của viện Công nghệ Thực phẩm Hà Nội và thu được kết quả như sau:
Bảng 3.7. Hàm lƣợng protein của các mẫu cơ chất trƣớc và sau khi lên men
Mẫu trước lên men Lượng protein tổng số (mg/g) Mẫu sau lên men Lượng protein tổng số (mg/g) Vỏ lạc 45,12 Vỏ lạc 72,53
Lõi ngô 24,23 Lõi ngô 38,21
Vỏ trấu 13,12 Vỏ trấu 27,34
4: 3: 3 32,11 4: 3: 3 62,23
4:4:2 27,16 4:4:2 44,50
Qua kết quả phân tích được thể hiện ở bảng 3.7 chúng ta nhận thấy rằng: Sau khi tiến hành lên men rắn bằng chủng nấm mốc M4V trên các nguồn cacbon khác nhau là vỏ trấu, vỏ lạc, lõi ngô và sự phối trộn các phế phụ phẩm theo tỉ lệ 4 vỏ trấu : 4 vỏ lạc : 2 lõi ngô; 4 vỏ trấu : 3 vỏ lạc : 3 lõi ngô đã làm