4. Ý nghĩa của đề tài
2.2.2.2. Phương pháp xác định hoạt tính carboxymethylcellulase
Dựa theo phương pháp của Miller. Nguyên lý
CMC-ase phân cắt cacboxymethylcellulose (CMC) và amylase phân cắt tinh bột thành các oligosacaride và glucose có tính khử có khả năng bắt màu vàng cam đặc trưng với thuốc thử DNS khi đun nóng.
SVTH: Nguyễn Thị Dung 31 K35B – SP Sinh
Tiến hành thí nghiệm
Pha dung dịch gốc 10 µmol/ml D-glucose trong đệm 50 mM Na-acetate. Từ đó pha loãng thành các nồng độ 0; 2; 4; 6; 8; 10 (µmol/ml). Lấy 50 µl dịch D-glucose ở mỗi nồng độ trên + 450 µl dịch 0,5% CMC (hoặc 1% tinh bột ngô) + 750 µl dịch thuốc thử DNS. Đun cách thuỷ trong 5 phút, làm lạnh và đo ở bước sóng λ540nm .
Đường chuẩn thể hiện mối liên quan giữa nồng độ D-glucose và giá trị OD được xây dựng nhờ chương trình Microsoft Excel thể hiện ở phương trình thể hiện mối tương quan giữa hàm lượng D-glucose và giá trị OD540nm là
y = 18,582x+0,261.
Trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch x là giá trị OD540nm tương ứng
Hệ số tương quan R2 = 0,9876 chứng tỏ mối liên quan giữa x và y là rất chặt chẽ.
Xác định hoạt tính của CMCase
Cân 1 gram mẫu thí nghiệm, pha loãng 10 ml nước cất, lắc đều, lọc dịch lọc thu được mẫu cần kiểm tra. Sau đó lấy 450 µl dung dịch 0,5% CMC + 50 µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp. Ủ ở 50oC trong 30 phút, sau đó bổ sung 750 µl dung dịch DNS để dừng phản ứng.
Mẫu đối chứng: 50 µl dịch enzyme đã pha loãng thích hợp + 750 µl dung dịch DNS làm bất hoạt enzyme + 450 µl dung dịch 0,5% CMC , ủ ở 50oC trong 30 phút.
Đun cách thuỷ mẫu thí nghiệm và đối chứng trong 5 phút, cho qua nước lạnh. Đo độ hấp phụ ở bước sóng λ540nm. Từ giá trị OD ta tính được lượng
đường khử được tạo ra nhờ đường chuẩn theo phương trình
SVTH: Nguyễn Thị Dung 32 K35B – SP Sinh
Trong đó: y là hàm lượng D-glucose trong 1ml dịch x là giá trị OD540nm tương ứng.
Từ kết quả thí nghiệm ta tính được IU/gam cơ chất khô [19].