4. Ý nghĩa của đề tài
2.2.2.3. Phương pháp xác định protein tổng số
Dựa theo phương pháp của Bradford (1976). Nguyên lý
Phương pháp dựa trên sự bắt màu của protein khi có mặt của dịch nhuộm Bradford (thành phần chính là Coomassie Brilliant Blue G-250 (CBB- 250)) có tính bám đặc hiệu đối với các amino acid trên bề mặt các phân tử protein cần phân tích. Các phân tử thuốc thử có chứa 6 nhóm phenyl và 2 nhóm acid sulfunic. Do đó các tương tác chủ yếu xảy ra đối với các đuôi kị nước (tryptophan, tyrosine, histidine và phenylalanine), tích điện âm (arginine, lysine) và là các liên kết yếu hoặc không đồng hoá trị.
Tiến hành thí nghiệm
Dựng đường chuẩn BSA, chuẩn bị dung dịch BSA hàm lượng 0,5 mg/ml bằng cách pha loãng 2 lần dung dịch mẹ đã chuẩn bị với H2O siêu sạch. Tiến hành xây dựng đường chuẩn kết quả thể thu được phương trình đường chuẩn
y = 22,786x-0,3047
Trong đó: y là lượng BSA có trong 1ml dịch x là giá trị OD595nm tương ứng
Hệ số tương quan R2 = 0,9928 chứng tỏ mối liên hệ giữa y và x là chặt chẽ.
Cân 1 gram mẫu thí nghiệm, pha loãng 10 ml nước cất, lắc đều, lọc dịch lọc thu được mẫu cần kiểm tra. Xác định protein tổng số, tiến hành thí nghiệm bằng cách lấy 800 µl dung dịch protein cần kiểm tra (đã pha loãng phù hợp) và bổ sung thêm 200 µl thuốc thử Bradford. Ủ trong 15-20 phút ở điều kiện phòng, đo độ hấp phụ ở A595nm. Xác định hàm lượng protein theo phương
SVTH: Nguyễn Thị Dung 33 K35B – SP Sinh
trình thu được y = 22,786x-0,3047 trong đó y là lượng BSA có trong 1 ml dịch, x là giá trị OD595nm tương ứng.
Từ kết quả phân tích ta tính ra được lượng protein tổng số/ gam mẫu [22].