Trong nghiên cứu này, chúng tôi tiến hành cố định nấm men trong gel alginate bằng phương pháp tạo gel từ bên ngoài. Quy trình cố định được mô tả như trong hình 3.3.
Nấm men Nhân giống Ly tâm Pha loãng Alginate Tạo dung dịch Hấp tiệt trùng Nước vô khuẩn
Trộn theo tỉ lệ 1:1 (v/v) Tạo hạt trong dd CaCl2
Rửa hạt
Hạt tế bào nấm men cố định
Làm nguội
Nước vô khuẩn
Phần lỏng
Hình 3.27: Quy trình cố định nấm men trong gel alginate bằng phương pháp tạo gel từ bên ngoài
• Nhân giống
−Nấm men trước khi sử dụng cần được nhân giống hai cấp:
• Cấp 1: lấy từ một đến hai vòng que cấy nấm men từ ống giống gốc để cấy vào 10mL môi trường nước nho (đã bổ sung thêm 150ppmN và đã được tiệt trùng), nuôi cấy trong 24h, ở nhiệt độ 30oC.
• Cấp 2: cho toàn bộ canh trường nhân giống cấp 1 vào 100mL môi trường nước nho (đã bổ sung thêm 150ppmN, hiệu chỉnh đến nồng độ chất khô là 15oBx và đã được tiệt trùng), nuôi cấy trong 24h, ở nhiệt độ 30oC.
• Ly tâm
−Sau khi nhân giống, nấm men được đem ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút, ở nhiệt độ 40C, thời gian 30 phút, để tách sinh khối.
• Pha loãng
−Dùng nước vô khuẩn pha loãng sinh khối nấm men đã ly tâm ở trên để đạt dung dịch huyền phù nấm men mật độ 50.106 tế bào/mL.
• Tạo dung dịch alginate
• Hấp tiệt trùng
−Vô khuẩn dung dịch alginate ở 1210C, trong 20 phút.
• Làm nguội
−Làm nguội dung dịch alginate sau khi hấp tiệt trùng đến nhiệt độ thường.
• Trộn
−Trộn dịch huyền phù tế bào nấm men 50.106 tế bào/mL với dung dịch alginate 4% theo tỉ lệ 1:1 (v/v) để tạo hỗn hợp đồng nhất.
• Tạo hạt
−Nhỏ từng giọt hỗn hợp alginate natri-nấm men vào dung dịch CaCl2 2%. Đường kính ống nhỏ giọt 3mm, lỗ ra đặt cách mặt trên của dung dịch CaCl2 2cm, hạt được tạo thành có đường kính khoảng 4÷5mm. Dung dịch CaCl2 được khuấy đảo liên tục trên bàn khuấy từ với tốc độ 100÷200 vòng/phút. Mỗi giọt hỗn hợp alginate nấm men rơi xuống dung dịch sẽ tạo thành một hạt nấm men cố định.
• Ngâm hạt
−Hạt nấm men cố định tạo ra được ngâm trong dung dịch CaCl2 2% trong 2 giờ, tốc độ khuấy đảo hạt vẫn giữ từ 100÷200 vòng/phút. Ta phải thay mới dung dịch CaCl2 2% sau mỗi giờ ngâm để nồng độ ion Ca2+ trong dung dịch không bị giảm xuống quá thấp.
• Rửa hạt
−Chắt bỏ dung dịch CaCl2, rửa lại hạt gel bằng nước cất và dịch lên men để muối CaCl2
không còn bám trên bề mặt hạt gel. Chúng tôi tiến hành rửa hạt gel 2 lần bằng nước cất và một lần bằng dịch lên men cho tất cả các thí nghiệm.
−Hạt sau khi được tạo thành phải được tiến hành lên men ngay. Nếu muốn bảo quản hạt thì cho hạt gel chứa nấm men cố định vào dung dịch CaCl2 0,4%, bảo quản ở 5oC trong vòng tối đa là 24h.