−Định lượng nitơ amin bằng phương pháp so màu với thuốc thử là ninhydrin.
3.3.4.1 Nguyên tắc
−Cơ chế phản ứng: Khi pH lớn hơn 4, các gốc nitơ amin tự do sẽ phản ứng với ninhydrin, tạo phức có màu xanh tím.
O O O R CH NH2 COOH O O OH H NH3 CO2 RCHO + + + + ninhydrin khử ninhydrin
O O OH H NH3 O O O O O O O N + + + phức Ruheman (xanh tím) 2H2O 3.3.4.2 Hoá chất
−Dung dịch chuẩn glycine: hòa tan 0,1072g glycine và định mức đến 100mL. Bảo quản ở 4oC. Trước khi sử dụng pha loãng dung dịch này 50 lần được dung dịch A.
−Hòa tan 10g Na2HPO4.12H2O, 6g KH2PO4, 0,5g ninhydrin và 0,3g fructose trong nước và định mức đến 100mL được dung dịch B. Chỉnh pH cuối 6,6 – 6,8. Dung dịch B được bảo quản trong tối ở 4oC, dùng trong 2 tuần.
−Hòa tan 1g KIO3 trong 300mL nước cất và 200mL cồn 96% v/v được dung dịch C. Dung dịch C được bảo quản ở 5oC.
3.3.4.3 Cách tiến hành
−Pha loãng dịch nho và dịch lên men 50 lần.
−Cho 2mL dung dịch đã pha loãng và 1mL dung dịch B vào mỗi 3 ống nghiệm. Đun cách thủy (ở 100oC) trong 16 phút, làm nguội về nhiệt độ 20oC trong bể nước 20oC trong thời gian 20 phút.
−Cho tiếp vào ống nghiệm 5mL dung dịch C, lắc đều và đo độ hấp thu ở bước sóng λ = 570nm trong vòng 30 phút.
−Làm 3 mẫu chuẩn song song với 2mL dung dịch A.
−Làm mẫu trắng với 2 mL dung dịch nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.
3.3.4.4 Kết quả
N = AA x2x100 2
1
−Trong đó:
• N: số mg nitơ amin có trong 1L dịch nho cần đo, mg/L
• A1: độ hấp thu của mẫu thí nghiệm (giá trị trung bình).