trình tạo sản phẩm
Trong nghiên cứu này, chúng tôi khảo sát động học quá trình tạo sản phẩm thông qua quá trình sinh tổng hợp cồn – sản phẩm chính của quá trình lên men và thông qua sự chuyển hóa của các acid hữu cơ.
3.4.3.1 Quá trình sinh tổng hợp cồn
Chúng tôi nhận thấy rằng, khi hàm lượng đường ban đầu tăng từ 200 – 280g/L thì hàm lượng cồn đạt được trong dịch lên men bằng nấm men tự do và nấm men cố định không có sự khác biệt đáng kể (P < 0,05) (Hình 4.10 và bảng 4.8). Nhưng khi hàm lượng đường tăng lên đến 320g/L thì bắt đầu có sự khác biệt. Khi đó, hàm lượng cồn tạo thành bởi nấm men cố định là 14,55%, còn hàm lượng cồn tạo thành bởi nấm men tự do là 13,73%. Và khi hàm lượng đường tăng lên 360g/L thì hàm lượng cồn tạo thành bởi nấm men cố định và nấm men tự do lần lượt là 14,00% và 13,25%.
Hình 4.37: Sự thay đổi hàm lượng cồn trong trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Bên cạnh đó, chúng tôi còn thấy rằng, khi hàm lượng đường tăng, hàm lượng cồn tạo thành bởi nấm men cố định tăng, chỉ khi hàm lượng đường tăng lên tới 360g/L thì hàm lượng cồn tạo thành mới giảm. Còn đối với nấm men tự do thì ngay khi hàm lượng đường ban đầu trong dịch nho tăng tới 320g/L thì hàm lượng cồ đã bắt đầu giảm, và khi hàm lượng đường ban đầu lên tới 360g/L thì giảm mạnh hơn. Điều đó cho thấy rằng khả năng sinh cồn của nấm men cố định ít bị ức chế bởi hàm lượng cơ chất cao so với nấm men tự do. Như đã trình bày ở trên, nguyên nhân là do nấm men cố định có khả năng chịu được áp suất thẩm thấu cao từ môi trường lên men. Ngoài ra, nguyên nhân còn do nấm men cố định có khả năng chịu được cồn cao hơn so với nấm men tự do. Nhiều tác giả cũng cho rằng nấm men cố định có khả năng chịu được nồng độ cồn cao hơn so với nấm men tự do (Desimone và cộng sự, 2002; Krisch và Szajáni, 1997; Hilge-Rotmann và Rehm, 1991; Parascandola và cộng sự, 1992; Holcberg và P. Margalith, 1981…) [91, 53, 117].
Theo Alexandre và cộng sự (1993), hàm lượng cồn cao ảnh hưởng đến màng tế bào chất và làm thay đổi quá trình vận chuyển các chất qua màng [117].
Khi hàm lượng ethanol tạo thành càng tăng thì lượng ethanol tích lũy nội bào càng tăng. Đồng thời, khi tăng hàm lượng đường trong môi trường thì áp suất thẩm thấu tác động đến tế bào càng tăng, cũng làm cho lượng ethanol tích lũy trong nội bào càng tăng. Do đó, enzyme alcohol dehydrogenase (ADH) sẽ bị bất hoạt và khả năng sống cũng như hoạt động của tế bào sẽ bị giảm đi đáng kể. Như đã biết, ADH là enzyme xúc tác phản ứng chuyển hóa acetaldehyde thành ethanol, do đó tế bào không còn khả năng sinh tổng hợp cồn nữa [59].
Bảng 4.23: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng cồn đạt được trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Hàm lượng cồn đạt được (%v/v)
Nấm men cố định Nấm men tự do
200 10,54 ± 0,13a 10,61 ± 0,09a
240 12,57 ± 0,15b 12,56 ± 0,22b
280 13,91 ± 0,11de 14,01 ± 0,10e
320 14,55 ± 0,06f 13,73 ± 0,08d
360 14,00 ± 0,09e 13,25 ± 0,08c
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
Theo nhiều tác giả thì nấm men cố định có khả năng chịu cồn cao hơn nấm men tự do là do nấm men cố định:
−Được bao bọc và bảo vệ bởi lớp vật liệu gel [113, 150, 206, 117, 133].
−Có sự thay đổi về khả năng vận chuyển các chất qua màng, do đó làm tăng khả năng giải phóng ethanol nội bào ra ngoài môi trường [150, 163, 206].
−Có hoạt tính enzyme ADH cao hơn [59].
Hình 4.38: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn trong trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Kết quả của chúng tôi cũng cho thấy rằng, khi hàm lượng đường ban đầu là 200g/L, tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại của nấm men cố định thấp hơn so với nấm men tự do (tương ứng là 1,46 và 1,60g/L/h). Và khi hàm lượng đường tăng lên 240g/L thì tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại của nấm men cố định và nấm men tự do khác biệt không đáng kể (P < 0,05) (Hình 4.11, bảng 4.9). Nhưng khi hàm lượng đường tăng cao hơn nữa, trong khoảng 280 – 360g/L thì tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại của nấm men cố định luôn cao hơn so với nấm men tự do. Kết quả trên lại một lần nữa chứng tỏ rằng hàm lượng cơ chất cao ức chế nấm men tự do mạnh hơn so với nấm men cố định.
Bảng 4.24: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu
(g/L) Nấm men cố địnhTốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại gPmax (g/L/h)Nấm men tự do
200 1,46 ± 0,03d 1,60 ± 0,04e
240 1,76 ± 0,06f 1,74 ± 0,06f
280 1,64 ± 0,04e 1,48 ± 0,05d
320 1,36 ± 0,05c 1,24 ± 0,04b
360 1,18 ± 0,05b 1,02 ± 0,04a
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
Hình 4.39: Sự thay đổi tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng trong trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Nhưng khi xét đến tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng cực đại thì nấm men cố định cho thấy có ưu thế hơn hẳn so với nấm men tự do. Tại giá trị 200g/L, tuy tốc độ sinh tổng hợp cồn cực đại của nấm men cố định thấp hơn so với nấm men tự do nhưng tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng cực đại của nấm men cố định lại cao gấp hơn 2 lần so với nấm men tự do (tương ứng lần lượt là 23,0 và 11,0 g/h/1012 tế bào). Còn tại các giá trị đường ban đầu khác thì tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng cực đại của nấm men cố định cũng cao gấp 1,5 – 2 lần so với nấm men tự do. Nguyên nhân có sự chênh lệch lớn như vậy là do mật độ tế bào nấm men cố định thấp hơn nhiều so với mật độ tế bào nấm men tự do. Như vậy, rõ ràng, tuy mật độ tế bào thấp nhưng khả năng sinh tổng hợp cồn của mỗi tế bào nấm men cố định là rất cao. Galazzo và Bailey (1988) cũng cho rằng tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng của nấm men cố định cao hơn 40 – 50% so với nấm men tự do [73].
Bảng 4.25: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Tốc độ sinh tổng hợp cồn riêng cực đại γPmax (g/h/1012 tế bào) Nấm men cố định Nấm men tự do
200 23,0 ± 0,4g 11,0 ± 0,3d
240 13,2 ± 0,6f 8,8 ± 0,5bc
280 12,4 ± 0,5e 8,0 ± 0,4b
320 13,4 ± 0,3ef 7,0 ± 0,2a
360 11,2 ± 0,3d 8,7 ± 0,5c
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 200 240 280 320 360
Hàm lượng đường (g glucose/L)
T ố c đ ộ s in h t ổ n g h ợ p c ồ n t ru n g b ìn h ( g /L /h ) Cố định Tự do
Hình 4.40: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Thêm vào đó, khi khảo sát tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình của nấm men cố định và nấm men tự do trong suốt quá trình lên men, chúng tôi cũng nhận thấy rằng tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình của nấm men cố định cao hơn hẳn so với nấm men tự do, gấp khoảng 1,5 – 2 lần. Khi hàm lượng đường cao (320 – 360g/L) thì sự chênh lệch này là lớn nhất). Kết quả này cũng phù hợp với nhiều nghiên cứu trước đây như Galazzo và cộng sự, 1987; Galazzo và Bailey, 1989, 1990; Doran và cộng sự, 1985; Parascandola và cộng sự, 1992; Ciani và Ferraro, 1996; Balli và cộng sự, 2003; Mallouchos và cộng sự, 2003,…
Parascandola và cộng sự (1992) khi nghiên cứu về nấm men cố định trong gel gelatin trong sản xuất rượu vang cũng đã kết luận rằng tốc độ sinh tổng hợp cồn của nấm men cố định cao hơn so với nấm men tự do mặc dù mật độ tế bào nấm men thấp hơn [154].
Bảng 4.26: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Tốc độ sinh tổng hợp cồn trung bình KP (g/L/h) Nấm men cố định Nấm men tự do
200 1,005 ± 0,038e 0,770 ± 0,026c
240 1,125 ± 0,026g 0,746 ± 0,023c
280 1,050 ± 0,022f 0,750 ± 0,010c
320 1,099 ± 0,017fg 0,598 ± 0,019b
360 0,933 ± 0,014d 0,526 ± 0,035a
0 0.4 0.8 1.2 1.6 2 200 240 280 320 360
Hàm lượng đường (g glucose/L)
H iệ u s u ất s in h t ổ n g h ợ p c ồ n (mo l e th an o l/ mo l g lu co se ) Cố định Tự do
Hình 4.41: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Tuy nhiên, khi đánh giá hiệu suất sinh tổng hợp cồn (số mol ethanol tạo thành trên một mol glucose) thì chúng tôi lại thấy rằng trong khoảng nồng độ 200 – 280g/L, hiệu suất sinh tổng hợp cồn của nấm men cố định và nấm men tự do không có sự khác biệt đáng kể (P < 0,05) (Hình 4.41, bảng 4.12). Nhưng khi hàm lượng đường ban đầu lên đến 320 – 360g/L thì hiệu suất sinh tổng hợp cồn của nấm men cố định thấp hơn so với nấm men tự do.
Điều đó cho thấy rằng mặc dù nấm men cố định chiếm ưu thế về tốc độ sử dụng đường và tốc độ sinh tổng hợp cồn nhưng hiệu suất sinh hợp cồn của nấm men cố định lại không cao hơn. Cùng với kết quả khảo sát động học quá trình sinh trưởng của nấm men, chúng tôi nhận thấy rằng mặc dù nấm men cố định sử dụng đường nhiều hơn nhưng chúng chỉ chuyển hóa một phần thành cồn và tăng mật độ tế bào. Kết quả này cũng tương tự như kết quả của Doran và Bailey (1985). Theo chúng tôi, nguyên nhân có thể là do tế bào nấm men cố định sử dụng nhiều đường để chuyển hóa thành các hợp chất trao đổi trung gian trong chu trình đường phân, tạo thành nhiều polysaccharide cấu trúc và polysaccharide dự trữ, tạo thành nhiều glycerol và acid béo no, do đó làm tăng khả năng trao đổi chất cũng như khả năng chịu đựng áp suất thẩm thấu của môi trường xung quanh. Ngoài ra, theo chúng tôi còn có một nguyên nhân khác nữa là do tế bào cố định duy trì pha cân bằng cho đến khi kết thúc quá trình lên men, trong khi đó mật độ tế bào tự do lại giảm đi nhanh chóng, do đó tế bào cố định cần sử dụng một lượng đường nhất định để duy trì sự ổn định này, nghĩa là duy trì tốc độ sinh sản bằng với tốc độ chết đi của các tế bào.
Bảng 4.27: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hiệu suất sinh tổng hợp cồn trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu
(g/L) Hiệu suất sinh tổng hợp cồn Nấm men cố định η (mol glucose/ mol ethanol)Nấm men tự do
200 1,58 ± 0,07cd 1,65 ± 0,07cde
240 1,63 ± 0,09cd 1,65 ± 0,06cde
280 1,57 ± 0,05c 1,62 ± 0,09cd
320 1,43 ± 0,11b 1,77 ± 0,08e
360 1,29 ± 0,06a 1,71 ± 0,09de
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,5).
3.4.3.2 Quá trình chuyển hóa các acid hữu cơ
Acid đóng một vai trò quan trọng trong rượu vang và là thành phần giúp ổn định rượu vang cũng như bảo vệ các tính chất cảm quan của rượu vang. Quá trình chuyển hóa các acid hữu cơ được chúng tôi đánh giá thông qua sự thay đổi pH, hàm lượng acid tổng và hàm lượng acid dễ bay hơi (hình 4.15, hình 4.16, hình 4.17).
Hình 4.42: Sự thay đổi pH trong trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Kết quả cho thấy rằng trong 36h đầu của quá trình lên men, pH giảm nhanh, sau đó giảm chậm trong 24h tiếp theo (trừ trường hợp của nấm men cố định ứng với hàm lượng đường ban đầu là 320 và 360g/L thì pH giảm chậm trong vòng 48h tiếp theo) và tăng chậm cho đến khi kết thúc quá trình lên men chính. Trong khi đó, hàm lượng acid tổng tăng dần trong 60h đầu của quá trình lên men (trừ trường hợp lên men dịch nho với hàm lượng đường ban đầu là 320 và 360g/L thì thời gian dài hơn), sau đó giảm nhẹ rồi giữ ổn định cho đến khi kết thúc quá trình lên men chính. Điều đó chứng tỏ rằng trong giai đoạn đầu, nấm men đã tổng hợp thêm các acid hữu cơ.
Hình 4.43: Sự thay đổi hàm lượng acid tổng trong trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Lamikanra (1997) cho rằng khi bắt đầu quá trình lên men, acid tartaric và acid malic chiếm ưu thế. Nhưng sau đó, hàm lượng acid tartaric và acid malic có xu hướng giảm dần. Đó là do acid tartaric dễ dàng kết hợp với potassium và calcium để tạo thành các hợp chất potassium bitartrate và calcium tartrate. Các hợp chất này sẽ kết tủa trong dịch nho trong quá trình lên men. Ngoài ra, acid tartaric còn có thể chuyển hóa thành acid lactic và acid acetic do hoạt động của vi khuẩn lactic. Còn acid malic cũng giảm do sự chuyển hóa của vi khuẩn trong dịch lên men. Trong khi đó, hàm lượng acid succinic thì tăng dần theo thời gian [59, 118].
Như vậy, hàm lượng acid tổng tăng trong giai đoạn đầu của quá trình lên men có thể là do độ tăng của acid succinic đủ lớn để bù lại độ giảm của acid tartaric và acid malic. Acid succinic được tạo ra chủ yếu từ glyoxylate và thường là sản phẩm trong quá trình sinh trưởng của nấm men. Khoảng 10 – 12% đường được chuyển hóa thành sinh khối nấm men trong suốt quá trình lên men và 0,3% trong số đó có thể chuyển thành acid succinic. Quá trình tạo thành acid succinic sẽ diễn ra liên tục cho đến khi tất cả đường lên men được sử dụng hết [118].
Kết quả thí nghiệm của chúng tôi cũng cho thấy rằng, trong suốt quá trình lên men, khi hàm lượng đường càng tăng thì hàm lượng acid tổng cũng như acid dễ bay hơi càng tăng.