3.3.3.1 Nguyên tắc
−Phương pháp này dựa trên phản ứng tạo màu giữa đường khử với với thuốc thử 3,5 – dinitrosalicylic acid (thuốc thử DNS). DNS có màu vàng trong dung dịch kiềm sẽ bị khử thành acid 3–amino-5-nitrosalicylic có màu đỏ cam.
NO2 OH COOH NO2 3C6H12O6 + + 4NaOH NH2 OH COONa NO2 3C5H11COONa + 3H 2O
−Cường độ màu của hỗn hợp phản ứng tỉ lệ thuận với nồng độ đường khử trong một phạm vi nhất định, được đo bằng máy quang phổ so màu. Dựa theo đồ thị đường chuẩn của glucose tinh khiết với thuốc thử, ta sẽ tính được hàm lượng đường khử của mẫu nghiên cứu. Hợp chất tạo thành có độ hấp thu mạnh nhất trong khoảng bước sóng 540 – 600 nm.
3.3.3.2 Hóa chất
• Thuốc thử 3,5-dinitrosalicylic acid
−Hòa tan 1g DNS (C7H4N2O7) và 1,6g NaOH trong khoảng 60 – 70mL nước cất. Sau đó cho 30g Kali Natri Tartrate (C4H4O6KNa.4H2O) vào hỗn hợp trên và khuấy cho tan hoàn toàn.
−Chuyển dung dịch trên vào bình định mức 100mL và định mức đến vạch.
−Dung dịch sau khi pha được bảo quản trong chai thủy tinh màu ở điều kiện lạnh (6-8oC), dùng tốt nhất trong 15 ngày.
• Dung dịch đường chuẩn
−Dung dịch đường chuẩn là dung dịch chứa hỗn hợp glucose và fructose với tỉ lệ 1:1 (w:w), có nồng độ là 2g/L.
3.3.3.3 Cách tiến hành
−Vì trong dịch nho có chứa nhiều acid hữu cơ, các chất màu và nhiều tạp chất khác nên ta phải tiến hành xử lý mẫu hợp lý để không làm ảnh hưởng đến kết quả thí nghiệm.
• Acid hữu cơ: trung hòa acid trong mẫu bằng dung dịch NaOH 0,1N.
• Chất màu và các tạp chất khác: cho dung dịch Ba(OH)2 0,3N và ZnSO4 5% với tỷ lệ 1:1 vào mẫu → Ba(OH)2 và ZnSO4 phản ứng với nhau tạo kết tủa, tách các chất màu và các tạp chất khác và làm trong mẫu.
• Dựng đường chuẩn
−Lần lượt cho 0,2; 0,4; 0,6; 0,8 và 1mL dung dịch chuẩn 2g/L vào 5 ống nghiệm khác nhau.
−Sau đó, lần lượt thêm vào các ống nghiệm 2,8; 2,6; 2,4; 2,2 và 2mL nước cất theo đúng thứ tự ống nghiệm như trên.
−Cho thêm vào mỗi ống nghiệm 1mL dung dịch DNS, lắc đều.
−Dùng một miếng nylon sạch bịt kín miệng ống nghiệm và tiến hành đun cách thủy ở nhiệt độ 100oC trong thời gian 5 phút.
−Làm nguội nhanh dung dịch, cho thêm 10mL nước cất và lắc đều cho đến khi dung dịch không còn phân lớp.
−Đo độ hấp thu A ở bước sóng λ = 540nm.
−Làm mẫu trắng với 1mL nước cất để hiệu chỉnh máy so màu về 0.
−Từ các kết quả đo được, ta tiến hành xây dựng đường chuẩn C = f(A).
• Xác định hàm lượng đường khử trong mẫu thí nghiệm
−Pha loãng mẫu sao cho nồng độ đường khử trong mẫu ≤ 2g/L.
−Lấy vào ống nghiệm 1mL mẫu, 2mL nước cất và 1mL dung dịch DNS, lắc đều. Sau đó tiến hành tương tự như trên.
−Từ đồ thị đường chuẩn ta xác định đường nồng độ đường khử có trong mẫu nghiên cứu.