trình sử dụng cơ chất trong quá trình lên men
Kết quả khảo sát của chúng tôi về ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến quá trình sử dụng chất khô trong lên men vang được trình bày như trong hình 4.3. Và chúng tôi cũng khảo sát kỹ hơn về quá trình sử dụng các hợp chất chính là đường, nitơ amin tự do và nitơ ammonium trong quá trình lên men (hình 4.4, hình 4.8, hình 4.9).
Hình 4.30: Sự thay đổi nồng độ chất khô trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Quan sát sự thay đổi hàm lượng chất khô trong suốt quá trình lên men chính (Hình 4.3), chúng tôi nhận thấy rằng mặc dù sự sinh trưởng của nấm men cố định kém hơn so với nấm men tự do nhưng khả năng sử dụng cơ chất của nấm men cố định tốt hơn nhiều so với nấm men tự do. Điều này cũng tương tự như nghiên cứu của nhiều tác giả khác: Galazzo và cộng sự, 1987; Galazzo và Bailey, 1989, 1990; Doran và cộng sự, 1985; Parascandola và cộng sự, 1992; Ciani và Ferraro, 1996; Balli và cộng sự, 2003; Mallouchos và cộng sự, 2003…. Sogoyan và cộng sự khi cố định nấm men trong chất mang alginate cũng đã kết luận rằng việc cố định nấm men làm tăng khả năng sử dụng cơ chất của nấm men 6 lần nhưng lại giảm khả năng sinh sản của nó 10 – 11 lần [138].
3.4.2.1 Quá trình sử dụng đường
Hình 4.31: Sự thay đổi hàm lượng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Trong suốt quá trình lên men, hàm lượng đường còn lại trong môi trường lên men bởi nấm men cố định luôn thấp hơn so với môi trường lên men bởi nấm men tự do. Đồng thời, hàm lượng đường sót trong canh trường của nấm men cố định cũng thấp hơn so với nấm men tự do (trừ trường hợp hàm lượng đường ban đầu là 200g/L thì sự khác nhau là không có nghĩa) (bảng 4.2). Bên cạnh đó, tốc độ sử dụng đường (thể hiện rõ hơn qua giá trị tốc độ sử dụng đường cực đại được trình bày trong bảng 4.3) của nấm men cố định cũng cao hơn so với nấm men tự do (trừ trường hợp hàm lượng đường ban đầu là 200g/L). Điều đó dẫn tới tốc độ sử dụng đường riêng và tốc độ sử dụng đường riêng cực đại (Hình 4.6, bảng 4.4) của nấm men cố định cũng cao hơn nhiều so với nấm men tự do. Tốc độ sử dụng đường riêng cực đại của nấm men cố định cao hơn khoảng 2 – 3 lần so với nấm men tự do.
Bảng 4.17: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến hàm lượng đường sót trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Hàm lượng đường sót (g/L) Nấm men cố định Nấm men tự do
200 2,01 ± 0,43a 2,40 ± 0,44a
240 3,10 ± 0,26a 7,80 ± 0,72b
280 10,00 ± 1,00b 15,32 ± 0,14c
320 22,73 ± 1,55d 85,80 ± 2,55f
360 76,95 ± 1,92e 124,98 ± 3,58g
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
Hình 4.32: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Dựa vào sự thay đổi tốc độ sử dụng đường trong suốt quá trình lên men (Hình 4.5), chúng tôi cũng thấy rằng tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định đạt cực đại sau 12h lên men (trừ trường hợp hàm lượng ban đầu là 360g/L thì sau 36h lên men), trong khi đó tốc độ sử dụng đường của nấm men tự do đạt cực đại trễ hơn, sau 36h lên men. Tương tự như vậy, nấm men cố định cũng đạt được giá trị tốc độ sử dụng đường riêng cực đại nhanh hơn nhiều so với nấm men tự do (12h so với 36h) (Hình 4.6).
Hình 4.33: Sự thay đổi tốc độ sử dụng đường riêng trong quá trình lên men rượu vang, sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate (hàm lượng đường ban đầu thay đổi trong khoảng 200 – 360g/L).
Điều đó cho thấy nấm men cố định có khả năng sử dụng đường nhanh hơn và triệt để hơn so với nấm men tự do, hay nói cách khác, khả năng trao đổi chất của nấm men cố định tốt hơn nhiều so với nấm men tự do. Ngoài nguyên nhân là nấm men cố định có khả năng chịu được áp suất thẩm thấu cao như trong phần 4.1.1 đã giải thích, nguyên nhân của hiện tượng này còn có thể được giải thích là do nấm men cố định đã có những thay đổi trong thành phần tế bào nên đã làm tăng khả năng vận chuyển các chất qua màng tế bào.
Ngoài ra, chúng tôi cũng thấy rằng khi hàm lượng đường ban đầu càng tăng thì hàm lượng đường sót cũng càng tăng. Đó là do khi nấm men đã lên men tới một mức độ nhất định, hàm lượng cồn tăng cao, nên đã ức chế hoạt động của nấm men, làm cho nấm men không còn khả năng tiếp tục sử dụng đường nữa.
Đối với nấm men cố định, khi hàm lượng đường tăng từ 200 – 240g/L thì tốc độ sử dụng đường cực đại tăng từ 3,32 – 3,91g/L/h. Nhưng khi hàm lượng đường tăng tiếp từ 240 – 320g/L thì tốc độ sử dụng đường thay đổi không đáng kể (P < 0,05). Còn khi hàm lượng đường ban đầu đạt đến 360g/L thì tốc độ sử dụng đường cực đại giảm xuống 3,59g/L/h. Tuy nhiên, đối với nấm men tự do thì khi hàm lượng càng tăng, tốc độ sử dụng đường cực đại càng giảm. Hiện tượng này cũng được giải thích là do nấm men cố định ít bị ức chế hơn so với nấm men tự do trong môi trường có nồng độ cơ chất cao. Chỉ khi nồng độ cơ chất rất cao (360g/L) thì mới làm giảm tốc độ sử dụng đường của nấm men cố định.
Bảng 4.18: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường cực đại của nấm men trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Tốc độ sử dụng đường cực đại gSmax (g/L/h) Nấm men cố định Nấm men tự do
200 3,32 ± 0,07c 3,72 ± 0,07e
240 3,91 ± 0,07f 3,49 ± 0,05d
280 3,89 ± 0,07f 3,36 ± 0,08c
320 3,85 ± 0,04f 2,68 ± 0,08b
360 3,59 ± 0,08d 2,33 ± 0,07a
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,5). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ngoài ra, kết quả nghiên cứu của chúng tôi cũng cho thấy rằng, thời gian lên men của nấm men cố định ngắn hơn nhiều so với nấm men tự do (bảng 4.6). Khi hàm lượng đường cao (320 – 360g/L) thì thời gian lên men của rượu vang sử dụng nấm men cố định chỉ còn khoảng ½ so với nấm men tự do.
Bảng 4.19: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường riêng cực đại trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Tốc độ sử dụng đường riêng cực đại γSmax (g/h/1012 tế bào) Nấm men cố định Nấm men tự do
200 56,0 ± 0,9f 26,0 ± 1,8c
240 50,9 ± 2,0e 17,9 ± 1,7b
280 54,0 ± 1,3f 17,6 ± 1,5b
320 58,9 ± 1,4g 14,1 ± 1,7a
360 59,0 ± 1,7g 38,0 ± 0,9d
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
Có nhiều cách khác nhau để xác định điểm kết thúc của quá trình lên men chính. Có thể xác định điểm kết thúc này dựa vào tốc độ sử dụng đường: điểm kết thúc là điểm mà tốc độ sử dụng đường gần như không đổi. Tuy nhiên, cách này sẽ không giúp chúng ta so sánh chính xác khả năng sử dụng cơ chất của nấm men cố định và nấm men tự do. Vì, như chúng tôi đã trình bày ở trên, nấm men cố định có khả năng sử dụng đường triệt để hơn so với nấm men tự do. Cho nên nếu xác định theo cách này, tại thời điểm kết thúc quá trình lên men chính, hàm lượng đường sót trong canh trường lên men bởi nấm men cố định sẽ thấp hơn hàm lượng đường sót trong canh trường lên men bởi nấm men tự do.
Vì thế, chúng tôi chọn cách xác định thời điểm kết thúc lên men dựa vào độ lên men. Khi đó, tại thời điểm kết thúc quá trình lên men chính, hàm lượng đường sót trong canh trường lên men bởi nấm men cố định và nấm men tự do sẽ bằng nhau.
Do chúng tôi khảo sát quá trình lên men khi hàm lượng đường ban đầu thay đổi khác nhau nên độ lên men cũng khác nhau. Ở đây, chúng tôi chọn độ lên men ứng với các hàm lượng đường ban đầu khác nhau như trong bảng 4.5.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L) Độ lên men (%) 200 98,7 240 97,5 280 94,3 320 74 360 65,1
Bảng 4.21: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến thời gian lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Thời gian lên men (h)
Nấm men cố định Nấm men tự do
200 79,2 ± 2,5a 108,0 ± 2,0d
240 86,4 ± 1,5b 132,0 ± 2,5e
280 100,8 ± 2,6c 146,4 ± 3,0f
320 79,2 ± 2,5a 180,0 ± 4,6g
360 84,0 ± 2,5b 196,8 ± 7,5h
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
Dựa vào thời gian lên men, chúng tôi xác định tốc độ sử dụng đường trung bình của nấm men cố định và nấm men tự do ứng với các hàm lượng đường ban đầu thay đổi khác nhau (hình 4.7, bảng 4.7). Kết quả cho thấy rằng nấm men cố định có tốc độ sử dụng đường trung bình cao hơn hẳn so với nấm men tự do, gấp khoảng 1,5 - 2 lần. Khi hàm lượng đường ban đầu đạt khoảng 320 – 360g/L thì tốc độ sử dụng đường trung bình của nấm men tự do giảm hẳn so với khi hàm lượng đường ban đầu là 200 – 280g/L. Doran và cộng sự, 1985; Galazzo và Bailey, 1990 cũng cho rằng khả năng sử dụng glucose của nấm men cố định cao gấp 2 nấm men tự do lần so với nấm men tự do [56, 74].
Tóm lại, qua việc khảo sát ảnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến quá trình sử dụng đường, chúng tôi nhận thấy rằng, về mọi mặt, nấm men cố định đều tốt hơn so với nấm men tự do:
−Hàm lượng đường sót thấp hơn. Đặc biệt ở những giá trị hàm lượng đường ban đầu cao (320 – 360g/L) thì hàm lượng đường sót trong dịch lên men bởi nấm men cố định thấp hơn hẳn.
−Tốc độ sử dụng đường cực đại cao hơn và thời gian để tốc độ sử dụng đường đạt đến giá trị cực đại cũng ngắn hơn.
−Tốc độ sử dụng đường riêng cao hơn hẳn.
−Tốc độ sử dụng đường trung bình cao hơn. Đặc biệt ở những giá trị hàm lượng đường ban đầu cao (320 – 360g/L) thì tốc độ sử dụng đường trung bình cao hơn hẳn. Giá trị tốc độ sử dụng đường trung bình cũng là giá trị biểu thị năng suất sử dụng đường của nấm men. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
−Thời gian lên men ngắn hơn. Đặc biệt ở những giá trị hàm lượng đường ban đầu cao (320 – 360g/L) thì thời gian lên men ngắn hơn hẳn.
0 0.5 1 1.5 2 2.5 3 3.5 200 240 280 320 360
Hàm lượng đường (g glucose/L)
T ố c đ ộ s ử d ụ n g đ ư ờ n g t ru n g b ìn h ( g /L /h ) Cố định Tự do
Hình 4.34: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Bảng 4.22: Aûnh hưởng của hàm lượng đường ban đầu đến tốc độ sử dụng đường trung bình trong quá trình lên men rượu vang sử dụng nấm men tự do và nấm men cố định trong gel alginate.
Hàm lượng đường ban đầu (g/L)
Tốc độ sử dụng đường trung bình KS (g/L/h) Nấm men cố định Nấm men tự do
200 2,49 ± 0,08d 1,83 ± 0,07c
240 2,71 ± 0,09ef 1,77 ± 0,08c
280 2,62 ± 0,08de 1,80 ± 0,06c
320 2,99 ± 0,07g 1,32 ± 0,08b
360 2,77 ± 0,09f 1,18 ± 0,08a
Các giá trị trong bảng biểu thị giá trị trung bình ± độ lệch chuẩn của 3 mẫu độc lập. Các giá trị có ký hiệu khác nhau biểu thị sự khác nhau có nghĩa (P < 0,05).
3.4.2.2Quá trình sử dụng nitơ (nitơ amin tự do và nitơ ammonium)
Như chúng ta đã biết, các hợp chất nitơ rất cần cho sự phát triển và trao đổi chất của nấm men. Theo Llauradó và cộng sự (2002), tốc độ lên men cực đại của nấm men có liên quan đến lượng hàm lượng nitơ trong dịch lên men. Tăng hàm lượng nitơ sẽ làm tăng quá trình tạo sinh khối và làm tăng tốc độ sử dụng đường. Thiếu hụt nitơ là một trong những nguyên nhân phổ biến nhất gây ra hiện tượng kéo dài thời gian lên men hoặc quá trình lên men kết thúc khi hàm lượng đường sót còn rất cao [85].
Kết quả khảo sát của chúng tôi về sự thay đổi hàm lượng nitơ hữu cơ và nitơ ammonium được trình bày như trong hình 4.8 và hình 4.9. Kết quả cho thấy rằng nấm men cố định có
khả năng sử dụng nitơ, ở dạng vô cơ lẫn dạng hữu cơ đều tốt hơn so với nấm men tự do. Nguyên nhân của hiện tượng này có thể được giải thích như sau:
−Như đã trình bày ở phần trên, nấm men cố định có khả năng sử dụng cơ chất tốt hơn so với nấm men tự do.
−Theo Boulton và cộng sự (1996) thì trong suốt quá trình lên men, các hợp chất amino acid và ammonium được hấp thu khi Saccharomyces cerevisiae bắt đầu phát triển và chúng được tàng trữ trong không bào cho đến khi cần sử dụng. Saccharomyces có thể tích lũy một lượng lớn các amino acid trong không bào và sau đó sử dụng các hợp chất này khi chúng cần đến bằng cách điều chỉnh sự giải phóng amino acid từ không bào vào tế bào chất [85]. Theo Pardonova và cộng sự (1986), khi cố định nấm men trong chất mang alginate, do ảnh hưởng của chất mang và quá trình cố định nên kích thước không bào sẽ tăng [138]. Do đó, nấm men cố định có khả năng tích lũy nitơ nhiều hơn so với nấm men tự do.
Kết quả này cũng tương tự với nghiên cứu của Divies (1989). Tác giả này cũng cho rằng nấm men cố định sử dụng nitơ amin tốt hơn so với nấm men tự do [193].
Ngoài ra, chúng tôi cũng thấy rằng hàm lượng nitơ amin giảm nhanh trong 36h đầu, sau đó giảm chậm dần và tăng nhẹ vào giai đoạn cuối của quá trình lên men. Nguyên nhân có thể là do vào cuối giai đoạn lên men, hàm lượng cồn tăng nên làm tăng lượng nấm men chết. Các nấm men này sẽ bị tự phân, do đó giải phóng ra ngoài môi trường lên men lượng nitơ amin chưa được sử dụng trong không bào [136]. Ngoài ra, theo Ogrydziak (1993),
Saccharomyces cerevisiae có chứa enzyme protease nội bào trong không bào [55]. Khi xảy ra quá trình tự phân, enzyme này sẽ được giải phóng ra ngoài môi trường và vẫn còn giữ được nguyên vẹn hoạt tính của nó. Do đó, protein chứa trong dịch nho và quan trọng hơn cả là các protein có mặt trong tế bào nấm men chết sẽ bị thủy phân tạo thành acid amin. Vì thế, hàm lượng nitơ amin trong môi trường tăng lên.