3 Phương phỏp nghiờn cứu
3.4 Phương phỏp kiểm tra chất lượng
Cỏc phương phỏp kiểm tra chất lượng văxin VNNB dựa vào thường qui và tiờu chuẩn của TCYTTG. Mỗi loạt văcxin thành phẩm phải giữ mẫu kiểm định 70 lọ/loạt (loại 5ml/lọ).
3.4.1 Kiểm tra vụ khuẩn
- Kiểm tra vụ khuẩn được thực hiện trờn 2 loại mụi trường là Thioglycholate và Soybean casein; mỗi loại 5 ống cấy 1ml/ống mẫu thử.
Thioglycholate ủở nhiệt độ 350C Soybean casein ủở nhiệt độ 220C
Theo dừi trong 14 ngày và đọc ghi kết quả cỏch ngày cho đến ngày thứ 14 với yờu cầu khụng cú nấm và vi khuẩn phỏt triển trong suốt thời gian theo dừi.
3.4.2 Kiểm tra an toàn chung
* Thử nghiệm trờn chuột lang:
Chọn chuột lang 150-300g khỏe mạnh, tăng trọng bỡnh thường. Thời gian thớch nghi điều kiện thử nghiệm (lồng chuồng, nhiệt độ và độ ẩm phũng, thức ăn...) ớt nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dựng 2 chuột lang. Tiờm 5ml vào đường phỳc mạc cho mỗi chuột. Theo dừi trọng lượng hàng ngày trong 7 ngày. Yờu cầu chất lượng sau tiờm chuột khỏe mạnh, bỡnh thường, tăng trọng.
* Thử nghiệm trờn chuột nhắt:
Chọn chuột nhắt trắng 5 tuần tuổi, khỏe mạnh, bỡnh thường. Thời gian thớch nghi
điều kiện thử nghiệm (như trờn chuột lang) ớt nhất 5 ngày. Mỗi mẫu thử nghiệm dựng 2 chuột nhắt. Liều tiờm 0,5ml vào đường phỳc mạc cho mỗi chuột. Theo dừi ớt nhất 7 ngày. Hàng ngày theo dừi trọng lượng và tỡnh trạng sức khỏe của chuột. Yờu cầu chất lượng sau tiờm 7 ngày chuột khỏe mạnh, bỡnh thường và tăng trọng.
3.4.3 Kiểm tra chất lượng gõy sốt
Văcxin bỏn thành phẩm và thành phẩm được kiểm tra chất lượng chất gõy sốt trờn thỏ. Đõy là phương phỏp nhậy nhất để phỏt hiện yếu tố gõy sốt trong văcxin.
Chọn thỏ cú trọng lượng ớt nhất 1,5kg. Những thỏđó thử nghiệm (-) cú thể dựng lại 3 lần hoặc lõu hơn kể từ ngày thử nghiệm trước nhưng khụng dựng để tiờm cựng 1 loại văcxin như lần trước. Khụng dựng thỏ trước khi tiờm cú thõn nhiệt > 39,8oC. Thớch nghi
điều kiện thử nghiệm trước 2 ngày về lồng chuồng, chế độ ăn và ở nhiệt độ 20-25oC. Nhiệt kế cú vạch chia đến 0,10C. Bơm kim tiờm vụ trựng loại dựng 1 lần. Khụng cho thỏ ăn mà chỉ cho uống nước 16giờ trước khi tiờm cho đến khi kết thỳc thớ nghiệm. Cốđịnh thỏ bằng dụng cụđặc biệt ở tư thế thoải mỏi. Đưa nhiệt kế vào hậu mụn 6-9mm. Đo nhiệt
độ trước khi tiờm 15phỳt. Mẫu thớ nghiệm để ở 37oC trước khi tiờm. Đường tiờm là tĩnh mạch tai. Liều tiờm 1ml/kg trọng lượng. Theo dừi đo và đọc nhiệt độ ớt nhất 3 lần với khoảng cỏch giữa 2 lần đo nhiệt độ khụng quỏ 60 phỳt. Nhiệt độ cao nhất của thỏ được ghi nhận trong 3 giờ sau khi tiờm được coi là nhiệt độ “tối đa”. Hiệu số giữa nhiệt độ ban
đầu và nhiệt độ tối đa được coi là nhiệt độ phản ứng. Nếu hiệu số này là õm tớnh thỡ phản
ứng được đọc là 0oC. Thử nghiệm tiến hành lần đầu trờn 3 thỏ và kết quả nhận định theo bảng dưới đõy. Nếu tổng nhiệt độ tăng nằm giữa cột 3 và 4 thỡ thử nghiệm phải tiến hành lại trờn số thỏ gấp đụi. Tổng nhiệt độ tăng của 6 thỏ được nhận định theo bảng. Thử
Bảng 4: Tiờu chuẩn kiểm tra chất gõy sốt (TCYTTG)
Thử nghiệm Tổng số thỏ tớch lũy Tổng nhiệt độ theo
tiờu chuẩn WHO Thvới tử nghiổng nhiệm khụng ệt độ là đạt
1 3 1,4oC 2,4oC
2 6 3,0oC 4,1oC
3 9 4,9oC 5,9oC
3.4.4 Kiểm tra bất hoạt (an toàn đặc hiệu)
chọn chuột nhắt trắng 11-13g khỏe mạnh, thể trạng phỏt triển tốt. Tiờm mẫu thử
0,03ml/con. Đường tiờm nóo chuột giữa điểm tai và mắt. Theo dừi sức khỏe trọng lượng chuột trong 14 ngày. Ngày thứ 14 đọc kết quả với thể trạng chuột khỏe mạnh và tăng trọng bỡnh thường, khụng hề cú cỏc triệu chứng bệnh lý là đạt yờu cầu.
3.4.5 Kiểm tra cỏc thành phần húa học
Đo độ pH:
Sử dụng mỏy đo pH Metter Toledo (Thụy Sĩ) với cỏc dung dịch chuẩn pH 4 và pH 7,02. Tiến hành đo pH như cỏc phương phỏp đo pH thụng thường. pH của văcxin phải trong khoảng 6,8-7,4. Cần chỳ ý rửa đầu từ và bảo quản đầu từđo pH cho sạch bằng cỏch sau khi đo pH phải rửa bằng nước cất 2 lần trong nhiều lần.
3.4.6 Định lượng TCA-protein trong văcxin
a) Nguyờn lý
Protein trong văcxin được tủa bằng axit tricloraxetic (TCA) rồi định lượng theo phương phỏp Lowry. Cỏc dung dịch protein chuẩn là albumin bũ cú nồng độ 50, 100 và 150àg/ml.
b) Chuẩn bị dung dịch
* Dung dịch A: Pha ngay trước khi dựng
Hũa tan 0,4g natri hydroxyt trong nước cất, thờm 4g natricarbonat, lắc cho tan đều. Thờm nước cất vừa đủ 100ml.
* Dung dịch B: Pha ngay trước khi dựng
Trộn đều dung dịch đồng sulfate 2% với 1ml natri taetrate 4%. * Dung dịch C: (thờm 1ml dung dịch B vào 50ml dung dịch A)
- Dung dịch axit tricloraxetic 10%: cõn 100g axit tricloraxetic rồi thờm nước cất vừa đủ
1000ml. c) Tiến hành
- Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng) vào cỏc protein chuẩn và cỏc mẫu chuẩn văcxin cỏc ống (mỗi mẫu 3 ống, mỗi ống 1ml)
- Thờm vào mỗi ống 1ml dung dịch TCA 10%
- Đun cỏch thủy 100oC, 15 phỳt sau đú để nguội ở nhiệt độ phũng. - Ly tõm 3500v/p trong 20 phỳt ở nhiệt độ phũng.
- Rửa tủa bằng 2ml dung dịch TCA 5%.
- Ly tõm 3500v/p trong 20 phỳt ở nhiệt độ phũng, loại bỏ nước nổi.
- Thờm vào mỗi ống 2,5ml dung dịch C, lắc đều, đểở nhiệt độ phũng 30 phỳt - Thờm vào mỗi ống 2,5ml nước cất.
- Thờm 0,5ml dung dịch folin để 37oC trong 30 phỳt, để nguội - Đo độ hấp phụở bước súng 750nm trờn mỏy đo quang phổ.
- Dựng đường chuẩn protein chuẩn rồi dựa theo đường chuẩn tớnh hàm lượng protein trong văcxin.
3.4.7 Định lượng Thimerosal
a) Nguyờn lý
Dựa trờn cơ sở thimerosal phản ứng với dithizon tạo thành hợp chất cú độ hấp phụ
cực đại ở bước súng 430nm. Đo độ hấp phụ của hợp chất tạo thành ở bước súng này. b) Chuẩn bị dung dịch
- Dung dịch Dithizon 0,002%: cõn 2mg dithizon, thờm carbontetraclorit vừa đủ 100ml. - Nước amonia 60% (9N): đong 60ml amonia, thờm nước cất vừa đủ 100ml
c) Tiến hành
- Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng), cỏc dung dịch thimerosal chuẩn và mẫu văcxin vào cỏc ống, mỗi ống 0,5ml (mỗi mẫu 2 ống).
- Thờm nước cất vừa đủ 5ml
- Thờm 10ml dithizon, lắc mạnh trong 5 phỳt.
- Đểở nhiệt độ phũng, nước và CCl4 tỏch thành 2 lớp. Hỳt bỏ lớp nước ở trờn. - Thờm 10ml nước cất, lắc mạnh. Để lắng rồi hỳt bỏ lớp nước ở trờn.
- Thờm nước amonia, lắc đều rồi hỳt bỏ lớp nước ở trờn (3 lần) - Rửa một lần nữa bằng 10ml nước cất. Hỳt bỏ lớp nước ở trờn. - Thờm 1 thỡa natri sulfate khan để ngừng phản ứng.
- Đo độ hấp phụở súng 480nm trờn mỏy quang phổ kế.
- Dựng đường chuẩn thimerosal rồi dựa vào đú tớnh hàm lượng thimerosal trong văcxin.
3.4.8 Định lượng formaldehyt
a) Nguyờn lý
Định lượng formaldehyt bằng phương phỏp đo cường độ màu của 3,5diacetyl 4- dihydrothidin ở bước súng 415nm. Phức hợp này được tạo thành do phản ứng của formaldehyt chứa trong văcxin với acetylaceton và amonia trong mụi trường axit nhẹ. b) Chuẩn bị dung dịch
- Dung dịch formaldehyt chuẩn: Cõn 388,8mg examethylen tetramin, thờm nước cất vừa đủ 500ml. Nồng độ formaldehyt trong dung dịch này bằng 1000àg/ml. Từ dung dịch này pha cỏc dung dịch formaldehyt cú nồng độ 2, 4 và 6àg/ml.
- Dung dịch acetylaceton: Hũa tan 150g amoniaacetat trong một lượng nước thớch hợp, thờm 30ml axit acetic và 2ml acetylaceton rồi thờm nước cất vừa đủ 1000ml.
c) Tiến hành
Nhỏ lần lượt nước cất (làm đối chứng) cỏc dung dịch formaldehyt chuẩn và mẫu văcxin vào cỏc ống (2ml/ống; mỗi mẫu 2 ống). Thờm vào mỗi ống 2ml acetylaceton (đó pha amoniaacetat và axit acetic). Đun cỏch thủy 100oC trong 15 phỳt, rồi làm nguội bằng nước vũi. Đo độ hấp phụở bước súng 415nm trờn mỏy quang phổ kế. Dựng đường chuẩn nồng độ formaldehyt rồi dựa vào đú để tớnh hàm lượng formaldehyt trong văcxin.
3.4.9 Phương phỏp thử nghiệm LD50 (Reed và Muench)
- Mẫu thử là virut sống.
- Động vật thử nghiệm: chuột swiss 11-13g khỏe mạnh. - Nồng độ pha tiờm: 10-1, 10-2, 10-3, ... 10-9.
- Đường tiờm: nóo (IC) điẻm giữa tai và mắt.
- Thời gian theo dừi 14 ngày sau khi tiờm (thời gian ủ bệnh tối đa của virut VNNB). - Để chuẩn độ hiệu giỏ virut thường bỏ 3 nồng độđầu (10-1-10-3) bắt đầu tiờm 10-4,
vỡ từ 10-1-10-3 thường chuột chết 100% (virut trước bất hoạt). - Mụi trường pha: TCM199 cú đỏ trung tớnh và 0,02% gelatin. - Mỗi nồng độ tiờm 10 chuột.
Vớ dụ: chủng Bei (42)2.
Pha tiờm: Bảng : Sơđồ chuẩn độ LD50 của chủng Bei(42)2 Nồng độ pha Số chuột thứ tự
10-1 10-2 10-3 10-4/ngày 10-5/ngày 10-6/ngày 10-7/ngày 10-8/ngày 10-9/ngày
1 + + + + + + 2 + + + + 12/11/02 + + 3 + + 11/11/02 + 11/11/02 + + + 13/11/02 4 + + + + + 13/11/02 + 14/11/02 5 + + + + + - 6 + + + 12/11/02 + + - 7 + + + + + - 8 + 11/11/02 + + + + 14/11/02 - 9 + + + + - - 10 + 12/11/02 + 12/11/02 + 13/11/02 + 13/11/02 - - Phương phỏp tớnh LD50
• Số chuột chết: được tớnh gộp bằng số chuột chết ở nồng độđú cộng với số chết ở
cỏc nồng độ pha loóng x100. • Số chuột sống: bằng số chuột sống ở nồng độđú cộng với số sống ở cỏc nồng độ đặc hơn. Vớ dụở bảng Σ chết Σ số sống Ở nồng độ 10-4 52 0 10-5 42 0 10-6 32 0 10-7 22 0 10-8 12 2 10-9 4 8 50% TCM 199 10-1 10-2 10-3 10-4 10-5 10-6 10-7 10-8 10-9 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 1,8ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml 0,2ml Bei(42)2
* Tớnh (%) chuột chết ở mỗi nồng độ theo cụng thức * Để tớnh LD50cần cú giỏ trị lớn nhất > 50% và cú giỏ trị nhỏ nhất < 50% Vớ dụ: ở trờn cú nồng độ 10-8 thỡ: 85,71% 2 12 100 12 = + = x x nếu nồng độ là 10-9 thỡ: 33,33% 8 4 100 4 = + = x x * Cụng thức tớnh Vậy LD50 của Bei (42)2 = 10-8,68
3.4.10 Phương phỏp thử nghiệm tạo đỏm hoại tử (PFU)
* Chuẩn bị tế bào BHK21
- Chuẩn bị tế bào BHK21 cú nồng độ 2,4x104 tế bào/ml trong mụi trường MEM cú huyết thanh bờ bào thai (FBS) 10%
- Bơm vào hộp lồng nhựa (Nunc) cú φ bằng 6cm (Petri dish - đĩa Petri) với thể tớch 5ml/hộp.
- Để tửấm CO2 trong 72giờ, tế bào kớn 1 lớp, đều đẹp khi soi dưới kớnh hiển vi quang học.
* Chuẩn bị mẫu cần chuẩn độ (virut VNNB) - Pha loóng mẫu từ 10-4-10-8. - Mỗi nồng độ gõy nhiễm 3 đĩa. - Thể tớch gõy nhiễm 0,2ml. Túm tắt qui trỡnh như sau: Tế bào BHK21 1 lớp đều đẹp trờn đĩa Petri ↓
Hỳt hết mụi trường nuụi tế bào
↓
Cấy 0,2ml dung dịch virut đó pha
↓ Lỏng đều mặt tế bào x = Số chuột chết x 100 Σ chuột sống và chết ở cựng nồng độ = Số cú giỏ trị >50% - 50 Số cú giỏ trị >50% - số cú giỏ trị <50% 85,71 - 50 85,71-33,33 = 0,68
↓ Tiếp xỳc 90 phỳt ở tủấm CO2 370C (15 phỳt lỏng 1 lần) ↓ Phủ lớp thạch thứ nhất: 5ml/đĩa ↓ Để nhiệt độ phũng 30 phỳt cho đụng thạch ↓
Lật ỳp đĩa Petri, để lại tủấm CO2 370C trong 3 ngày
↓ Phủ lớp thạch thứ 2: 2,5ml/đĩa ↓ Để nhiệt độ phũng 30 phỳt cho thạch đụng ↓ Để tủấm CO2 từ 4-5 giờ ↓ Đếm cỏc đỏm hoại tử (plaque) và ghi lại trờn nắp hộp * Cỏch tớnh PFU trong 1ml: Cụng thức tớnh (5 là thể tớch cấy 1 đĩa 0,2ml x 5 = 1ml) Vớ dụ: ở nồng độ 10-6: cú 3 đĩa: đĩa 1: 14 plaque đĩa 2: 12 plaque đĩa 3: 13 plaque Tổng: 39 Số plaque trung bỡnh/đĩa: 39 : 3 = 13 Tớnh PFU: 10-6 x 13 x 5 = 65 x 106 = 6,5 x 107 = 0,65 x 108 3.4.11 Kiểm tra cụng hiệu của văcxin a) Nguyờn lý
Cụng hiệu của văcxin VNNB dựa trờn hiệu giỏ khỏng thể trung hũa sau khi gõy miễn dịch cho chuột nhắt trắng. Hiệu giỏ khỏng thể trung hũa được tớnh bằng giỏ trị 50% giảm đỏm hoại tử.
b) Tiến hành
* Gõy miễn dịch cho chuột nhắt trắng 11-13g:
Chỳ ý: mẫu văcxin và mẫu chuẩn cựng làm song song. Một lỳc cú thể làm nhiều mẫu văcxin với một mẫu văcxin chuẩn.
* Pha văcxin: - Văcxin mẫu chuẩn là EJP034A (BIKEN)
- Văcxin mẫu thử
Tỷ lệ pha: 1/16; 1/32; 1/64; (nhúm A: x 16; B: x 32 và C: x 64) Dung dịch pha: M/75 pH 7,4 cú 0,02% gelatin.
* Gõy miễn dịch cho chuột:
+ Số chuột cần tiờm: mỗi nồng độ 10 con
+ Liều tiờm: 0,5ml/con x 2 liều cỏch nhau 7 ngày. + Đường tiờm: phỳc mạc (IP)
+ Lấy mỏu tim: 7 ngày sau khi tiờm mũi 2. Mỏu lấy và để riờng của từng con chuột.
Để 4oC qua đờm.
+ Chắt huyết thanh: dựng pipett man hỳt 100àl của mỗi tube (của 1 con chuột). Hộn vào 1 tube theo nhúm A, B, C...
+ Ly tõm 3000v/p trong 30 phỳt. Lấy nước nổi.
+ Pha huyết thanh 1/10 trong LE cú 0,2% BA bảo quản –20oC