PHẦN 3 NỘI DUNG VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.2.Phƣơng pháp tiến hành Ly trích RNA tổng số
Sử dụng qui trình ly trích RNA theo hướng dẫn của nhà sản xuất (Phụ lục 2) để thu RNA tổng số. Dịch ly trích RNA được sử dụng trong các phản ứng RT-PCR. RNA của PMWaV (nếu có) sẽ được khuếch đại nhờ các primer đặc hiệu với đoạn gen HSP 70 của virus. Sản phẩm khuếch đại RT-PCR được thể hiện trên gel điện di. Nhuộm ethidium bromide và chụp hình gel bằng tia UV để đọc kết quả.
Thực hiện RT-PCR
Bƣớc 1: chuẩn bị hỗn hợp phản ứng. Các hoá chất cần chuẩn bị như sau:
Nuclease –free light mineral oil (Sigma Cat # M5904) Hỗn hợp phản ứng (reaction mix)
Bảng 3.3 Thành phần mix phản ứng RT - PCR
Thành phần mix RT - PCR Thể tích sử dụng
Nuclease – Free water X l
MMV/Tfl 5X ( ủ ở 650C 15 phút trước khi pha) 10 l
dNTP (*) 1 l
Primer xuôi và ngược (**) 50 pmol/loại
25 nM MgSO4 (*) 2 l AMV RT ( 5 u / l ) 2 l Tfl DNA polymerase ( 5 u / l ) 1 l Dịch ly trích RNA 2 l Thể tích cuối V = 50 l Ghi chú:
(*) Vortex trước khi sử dụng
(**) Primer đặc trưng cho HSP 70 của PMWaV-1,2 do IDT (Intergrated of DNA technologies, USA) cung cấp
Pha mix trong tube 0,5 ml và trộn đều bằng pipet. Sau khi thêm AMV RT và Tfl DNA polymerase vào, vortex hỗn hợp trong 10 giây.
Phủ lên mỗi tube 1- 2 giọt Nuclease – free mineral oil. Đặt tube vào bồn giữ nhiệt ủ ở 450C trong 45 phút.
Cài đặt chương trình nhiệt cho phản ứng RT-PCR một bước gồm quá trình tổng hợp cDNA và khuếch đại RNA.
Chu kì nhiệt cho phản ứng
Giai đoạn 1 (thực hiện phiên mã ngược)
Tổng hợp sợi cDNA : 450C/ 45 phút (1 chu kì); 940C/2 phút (1 chu kì) Giai đoạn 2 (phản ứng PCR)
cDNA được khuếch đại theo chương trình nhiệt sau:
920C/30 giây, 580C/1 phút, 680C/90 giây (10 chu kì); 920
C/30 giây, 540C/1 phút, 680C/90 giây (35chu kì).
680C/8 phút (1 chu kì).
Điện di sản phẩm
Chuẩn bị hỗn hợp điện di 5 l/ giếng (3,5 l mẫ + 1,5 l loading dye)
Load hỗn hợp lên gel agarose 1,5% và chạy điện di trong 60 phút ở 50V cho đến khi vạch màu loading dye chạy đến 2/3 chiều dài gel.
Buffer điện di là TAE 0,5X.
Nhuộm Ethidium bromide 15 phút và chụp hình gel dưới tia UV và đọc kết quả.
Mẫu kiểm tra
Gồm 12 mẫu lá của chồi dứa Cayenne tái sinh từ ĐST như sau:
Bảng 3.4 Các mẫu lá của chồi dứa tái sinh từ ĐST được kiểm tra PMWaV bằng kĩ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
thuật RT-PCR
Giống Xử lí nhiệt Số mẫu kiểm tra
TQ - 1 TL - 1 LĐ - 1 TQ + 3 TL + 3 LĐ + 3
Ghi chú: TQ: Trung Quốc, TL: Thái Lan, LĐ: Lâm Đồng; (-): không xử lí nhiệt, (+): xử lí nhiệt.
PHẦN 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1. Khảo sát khả năng tái sinh của ĐST nuôi cấy trên môi trƣờng MS