4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN
2.3. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Nghiên cứu sản xuất kháng thể đơn dòng và việc tìm ra liều lượng kháng nguyên thích hợp để gây được đáp ứng miễn dịch cho chuột là rất quan trọng. Đây là tiền đề cho việc thu nhận tế bào lympho B sản sinh kháng thể đơn dòng sau này.
Trong thí nghiệm nghiên cứu của chúng tôi, có 6 chuột cái BALB/c 6 tuần tuổi được chia làm ba lô thí nghiệm và gây miễn dịch với liều lượng kháng nguyên AFP khác nhau:
- Lô số 1 gồm chuột số 1.1 và 1.2 sử dụng liều lượng 1,25
µg/con/lần
- Lô số 2 gồm chuột số 2.1 và 2.2 sử dụng liều lượng 2,5
µg/con/lần
- Lô số 3 gồm chuột số 3.1 và 3.2 sử dụng liều lượng 5
µg/con/lần
Sau khi những con chuột này được tiêm kháng nguyên để gây đáp ứng miễn dịch, lại tiếp tục được đem nuôi trong điều kiện bình thường để phục vụ cho những thí nghiệm tiếp theo.
Tiêm chủng Cloning Chọn lọc dòng tế bào Nhân invitro Tách chiết
2.3.1.Gây miễn dịch cho chuột
Kháng nguyên X
Dung hợp tế bào Đại thực bào Tế bào Lympho B mẫn
cảm kháng nguyên Tế bào Myeloma
Động vật thí nghiệm
Quần thể tế bào lai
Kháng thể đơn dòng kháng nguyên X
Dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng
Một tế bào lai sinh kháng thể kháng kháng nguyên X
Theo phương pháp của Milstenin và Kohler đưa ra năm 1975, có cải tiến. Trộn kháng nguyên AFP với một dung lượng cùng thể tích của tá dược CFA có tác dụng làm tăng hoạt tính kháng nguyên và kích thích hệ thống miễn dịch. Lượng kháng nguyên AFP được pha chế ở nồng độ cao sao cho thể tích tiêm cho mỗi chuột mỗi làn là 0,2ml.
Ban đầu chuột cái BALB/c (6 tuần tuổi) được tiêm dưới da ở 4 vị trí dọc theo lưng. Chuột được tiêm nhắc lại vào dưới da bụng với cùng một lượng kháng nguyên trộn với cùng thể tích IFA để có nồng độ tiêm cho mỗi chuột trên là 0,2 ml vào tuần thứ 2 và thứ 4 sau lần tiêm thứ nhất. Các mẫu máu được lấy từ tĩnh mạch đuôi hoặc hốc mắt, tách huyết mạch để theo dõi hình thành kháng thể ELISA. Chuột được tiêm lần cuối cùng với một số lượng kháng nguyên AFP trong 0,1ml dung dịch nước sinh lý không trộn với tá dược vào tĩnh mạch đuôi lúc 3-4 ngày trước khi lấy tế bào lách dung hợp với tế bào myeloma.
2.3.2.Phương pháp lấy đại thực bào
Theo phương pháp của Oliver JP.Leger và Jose. Wsaldanha, 2000. - Giết chuột, khử trùng chuột trong cồn 700
- Tiêm vào xoang bụng 3ml đung dịch PBS
- Dùng bơm tiêm hút dung dịch trong xoang bụng ra, đưa vào ống ly tâm. Lặp lại như trên 3 lần. Dịch hút ra từ xoang bụng có chứa tế bào được kiểm tra dưới kính hiển vi. Cho dịch tế bào li tâm ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút.
- Sau ly tâm, hút bỏ dịch nổi, hòa lại cặn tế bào với 10 ml dung dịch PBS.
- Lặp lại bước rửa tế bào 3 lần. Lần cuối cùng cặn tế bào được hòa trong 1 ml DMEM có FBS 10%
- Đếm tế bào, pha điều chỉnh sao cho dịch tế bào có mật độ cần thiết là 103 tế bào/ml, trong môi trường DMEB 10% FBS.
2.3.3.Phương pháp đếm tế bào 2.3.3.1. Chuẩn bị Trypan blue 0,4%
- Trypan blue: 0,1g
- Màng lọc Millipore : 0,45µl
Lấy 25ml NaCl 0,85% hòa tan 0,1g Trypan blue, cho dung dịch qua màng lọc Millipore được trypan blue 0,4%
2.3.3.2. Đếm tế bào
Dung dịch tế bào được li tâm, hút hết dịch nổi hòa cặn vào 1 ml dung dịch môi trường.Dùng Pipet hút 100µl dung dịch tế bào với 100µl Trypan blue. Các tế bào chết có màu xanh, tế bào sống không bắt màu. Đưa vào dung dịch tế bào đã trộn với Trypan blue vào buồng đếm. Trừ những tế bào nằm trên 2 cạnh của ô vuông, đếm tế bào sống có trong 8 ô.
Tính tế bào trung bình của 8 ô sẽ được số tế bào trung bình trong 1 ô. Số tế bào được tính theo WHO:
N= m x tb x V x 104
Trong đó: N: số lượng tế bào/ml
m: số tế bào trung bình của 8 ô tb: độ pha loãng
V: Tổng thể tích trong buồng đếm
2.3.4.Phương pháp lấy tế bào LymphoB của tế bào chuột
Theo phương pháp của Oliver JP.Leger và Jose. Wsaldanha
Giết chuột đã được gây miễn dịch bằng kháng nguyên AFP, khử trùng chuột bằng cồn 700. Tách lấy thùy lách và các hạch vào đĩa petri có sẵn 10ml dung dịch PBS. Dùng kéo cắt lách và các hạch thành từng mảnh nhỏ, dùng kẹp gạt nhẹ để các tế bào rời nhau ra. Chuyển hỗn hợp tế bào sang ống ly tâm, dùng
pipet pasteur hút lên, đẩy xuống cho cụm tế bào rời nhau ra. Để dung dịch lắng cặn, hút lấy dung dịch tế bào sang một ống ly tâm khác. Ly tâm dung dịch tế bào ở tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó loại bỏ hết dung dịch nổi và hòa cặn tế bào trong 10 ml dung dịch PBS. Lặp lại thao tác này 3 lần, lần cuối cùng hòa cặn tế bào với DMEM với bổ sung 10% FBS sao cho có mật độ tế bào 108 tế bào/ml.
2.3.5 Nuôi cấy tế bào Myeloma dòng Sp 2/0 và P3X
2.3.5.1. Đánh thức và nhân nuôi tế bào Sp 2/0 và P3X
Chuyển ống tế bào từ trong Nito lỏng vào cốc nước có nhiệt độ 36- 370 C. Khi dung dịch bên trong ống cất đã tan đá hoàn toàn, lau khử trùng phía ngoài bằng cồn 700. Chuyển dung dịch bên trong ống sang một ống ly tâm, tiến hành ly tâm với tốc độ 1000 vòng/phút trong 5 phút. Gạn bỏ lớp dung dịch nổi chứa DMSO. Hòa tan cặn tế bào bằng môi trường nuôi cấy rồi chuyển tế bào sang chai nuôi cấy thích hợp. Sau đó để chai nuối cấy vào tủ ấm 370 C, 5% CO2. Sau khi tế bào được đánh thức thành công, phát triển bình thường, không bị nhiễm khuẩn, nhân nuôi để đạt lượng tế bào cần thiết 104 – 105 tế bào/ml môi trường nuôi cấy trung bình sau 2- 3 ngày môi trường phải được thay mới. Vì lúc này pH và chất dinh dưỡng cần cho sự phát triển tế bào đã thay đổi. Nếu môi trường không được thay đúng lúc, tế bào sẽ bị chết. Để thay đổi môi trường trước hêt cần lya tâm, hút bỏ môi trường cũ, tiếp đó đưa từ 5-7 ml môi trường nuôi cấy phù hợp. Để tủ ấm 370C, 5% CO2 và tiếp tục nuôi.
2.3.5.2. Bảo quản tế bào trong Nito lỏng
Chọn chai tế bào khỏe, tỷ lệ sống trên 95%, không bị nhiễm tạp nấm, vi khuẩn. Đổ bỏ môi trường cũ thay vào đó là môi trường mới, dùng pipet hút lên đẩy xuống nhẹ nhàng cho tế bào rời đều trong môi trường. Hút dung dịch
nổi, hòa cặn vào tế bào môi trường 10% FBS và 5% DMSO, cho dung dịch này vào ống cất. Tiến hành làm lạnh từ từ cho tới khi đạt được -250C thì đưa nhanh ống cất vào lạnh -700C, sau 20h chuyển vào bình Nito lỏng.
2.3.6. Dung hợp Tế bào và tách dòng
2.3.6.1. Dung hợp
Hỗn hợp dịch tế bào Lympho B (nồng độ 106/ml) được đưa vào phối hợp với tế bào Myeloma dòng Sp 2/0 và P3X.
Sau đó cho thêm vào 1 ml PEG khuấy trong một phút, 5 phút sau thêm vào 3,5ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT và ủ qua đêm ở 370C, 5% CO2, ly tâm hỗn dịch tế bào, hòa cặn vào 30 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT và phân phối vào các giếng của đĩa nhựa Falcon 0,1 ml. Sau dung hợp từ 5- 7 ngày thêm vào mỗi giếng 0,1 ml môi trường huyết thanh có bổ sung HAT. Sau 10 ngày dung hợp lấy dịch nổi và dùng phản ứng ELISA để phát hiện kháng thể mong muốn. Sau đó chọn tế bào từ các giếng có hiệu giá có kháng thể cao để tách dòng.
2.3.6.2. Tách dòng
Sau khi kiểm tra khả năng tạo kháng thể bằng ELISA, ta biết được giếng nào có kháng thể, tuy nhiên đây là kháng thể đa dòng do nhiều dòng tế bào lai tạo thành. Để có kháng thê đơn dòng ta phải tiến hành tách dòng như sau:
- Chọn 1 giếng mà dịch nổi có hiệu giá kháng thể cao nhất trộn đều các tế bào trong giếng đã chọn thành hỗn dịch tế bào thuần nhất. Hút hỗn dịch tế bào sang ống ly tâm có chứa môi trường phát triển để pha loãng tế bào sao cho nồng độ chỉ đạt 1 tế bào/100µl.
- Chuyển tế bào đã pha loãng sang nuôi trong các giếng đã có tế bào nuôi, sau đó chuyển vào nuôi trong tủ ấm CO2 ở điều kiện tiêu chuẩn.
- Sau khi tế bào phát triển tốt(gần kín đáy), kiểm tra lai hiệu giá kháng thể. Chọn ra giếng có hiệu giá kháng thể cao nhất nhân lên với lượng lớn để bảo quản hoặc tiêm vào ổ bụng chuột, thu dịch báng.
2.3.7.Phương pháp ELISA
* Nguyên lý: Dùng kháng thể( kháng thể 1) liên kết với kháng nguyên sau đó liên kết với kháng thể 2- gắn enzyme, tiếp đó cho cơ chất vào, cơ chất sẽ bị enzyme tác động tạo nên màu( do enzyme phân hủy cơ chất).
* Phản ứng ELISA gián tiếp gồm các bước sau:
1- Phủ bản bằng 100µl kháng nguyên Myelona trong coating buffer ở 400C qua đêm( nồng đọ khoảng 125 ng KN/giếng) kháng nguyên AFP sẽ gắn cố định trên bè mặt của bản. Rửa bản 5 lần bằng washing buffer để loại bỏ những kháng nguyên không gắn vào bề mặt bản. Che chắn bằng 300µl washing buffer + 1% skim milk trong 1h ở 370C. Rửa bản 5 lần bằng washing buffer
2- Bổ sung kháng thể 1( dịch nổi của môi trường nuôi cấy ) đã pha loãng 5000 lần bằng washing buffer + 1% sữa. Ủ ở 370C trong 1h. Rửa bản 5 lần bằng washing buffer lạo bỏ khán thể không liên kêt đặc hiệu với kháng nguyên.
3- Đưa vào mỗi giếng 100µl kháng thể 2 gắn enzyme peroxirase được pha loãng 10000 lần trong đệm washing buffer + 1% sữa. Đem ủ 370C trong 1h. Rửa bản 10 lần bằng washing buffer.
4- Đưa vào mỗi giếng 100µl dung dịch cơ chất TMB. Ủ bản ở 370C trong 10 phút.
5- Dừng phản ứng bằng cách bổ sung 50µl H2SO4 1N. 6- Đo giá trị OD450( độ quang học) bằng ELISA reader.
Chương 3:
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. ĐÁNH GIÁ KẾT QUẢ GÂY ĐÁP ỨNG MIỄN DỊCH TRÊN CHUỘT BẰNG KHÁNG NGUYÊN AFP CHUỘT BẰNG KHÁNG NGUYÊN AFP
Sau khi tiến hành nghiên cứu gây đáp miễn dịch trên chuột bằng kháng nguyên AFP, chúng tôi tiến hành lấy mẫu máu của từng chuột thí nghiệm và tách huyết thanh để thực hiện phương pháp ELISA gián tiếp. Để tiến hành phản ứng ELISA gián tiếp cần phải có 4 yếu tố là kháng nguyên đã biết, kháng thể 1 cần kiểm tra, kháng thể 2 gắn enzyme và cơ chất hiện màu.
Trong thí nghiệm được thực hiện, chúng tôi sử dụng cơ chất là TMB, enzym gắn kháng thể là peroxydase. Khi cơ chất và enzyme gặp nhau thì ứng sinh màu xanh da trời, màu vàng xuất hiện khi dừng phản ứng bằng H2SO4. Kết quả của phản ứng ELISA (giá trị mật độ quang học OD) được đo ở bước sóng 450 nm bằng máy Microplate Reader (Biorad) nhằm kiểm tra sự có mặt của kháng thể kháng đặc hiệu kháng nguyên AFP. Kết quả phản ứng ELISA xác định tương đối hàm lượng kháng thể kháng AFP trong huyết thanh được trình bày ở bảng 3.1 và hình 3.1
Bảng 3.1. Kết quả gây đáp ứng miễn dịch cho chuột với kháng nguyên AFP
Ghi chú: Đối chứng âm là BSA - bovine serume albumin 1%
Chuột thí nghiệm Chuột số 1.1 Chuột số 1.2 Chuột số 2.1 Chuột số 2.2 Chuột số 3.1 Chuột số 3.2 ĐC âm Giá trị OD 1,749 1,815 2,405 2,305 2,746 2,805 0,534 1,681 1,886 2,341 2,241 2,638 2,857 0,593 1,692 1,783 2,309 2,209 2,709 2,791 0,576 OD tbình 1,707 1,828 2,352 2,252 2,698 2,818 0,567 ±0,037 ±0,053 ±0,049 ±0,049 ±0,055 ±0,035 ±0,031
1.71 1.83 2.35 2.25 2.70 2.82 0.57 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0 2.5 3.0 Gi á trị O D Chuột 1.1 Chuột 1.2 Chuột 2.1 Chuột 2.2 Chuột 3.1 Chuột 3.2 ĐC âm Lô thí nghiệm
Kiểm tra đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên AFP
Chuột 1.1 Chuột 1.2 Chuột 2.1 Chuột 2.2 Chuột 3.1 Chuột 3.2 ĐC âm
Biểu đồ 3.1. Kiểm tra đáp ứng miễn dịch của các chuột thí nghiệm bằng phương pháp ELISA
Kết quả từ bảng 3.1 và hình 3.1 cho thấy:
Cả 6 chuột thí nghiệm đều có ĐƯMD tốt khi tiêm kháng nguyên AFP, tuy nhiên sự đáp ứng có khác nhau. Chuột số 1.1 và 1.2 có giá trị OD thấp nhất trong 3 lô chuột thí nghiệm tương ứng với ĐƯMD thấp nhất. Trong đó, chuột số 1.1 có OD trung bình là 1,707 và chuột số 1.2 có OD trung bình là 1,828 tương ứng với liều kháng nguyên 1,25 µg kháng nguyên/con/lần.
Kết quả phản ứng ELISA của hai chuột 2.1 và 2.2 có giá trị OD lần lượt là 2,352 và 2,252, cao hơn so với hai chuột ở lô 1 nhưng lại thấp hơn so với lô 3. Như vậy, ĐƯMD ở chuột lô 2 tốt hơn so với lô 1 nhưng lại kém hơn so với chuột ở lô 3.
Hai chuột 3.1 và 3.2 cho giá trị OD cao nhất lần lượt là 2,698 và 2,818 tức là lượng kháng thể có trong huyết thanh nhiều nhất. Điều này cũng đồng nghĩa với việc 2 chuột ở lô 3 có khả năng đáp ứng miễn dịch tốt nhất. Như
vậy liều 5 µg kháng nguyên AFP/con/lần là phù hợp và tạo được đáp ứng miễn dịch tốt nhất ở chuột thí nghiệm.
Bước nghiên cứu này là cơ bản nhưng hết sức quan trọng. Vì cơ thể nào tiết ra nhiều kháng thể khi một kháng nguyên lạ xâm nhập có nghĩa là hệ miễn dịch có xảy ra sự đáp ứng miễn dịch, các tế bào lympho hoạt động tốt, có sức sống cao. Căn cứ vào đó chúng tôi chọn ra được các cá thể có đáp ứng miễn dịch tốt nhất, các tế bào lympho có chất lượng cao để tách lấy tế bào lympho phục vụ cho việc lai tế bào sau này.
Từ các kết quả và nhận xét trên đây có thể rút ra kết luận là đáp ứng miễn dịch với kháng nguyên AFP phụ thuộc nhiều vào:
- Liều lượng kháng nguyên đưa vào cơ thể
- Từng cá thể khác nhau sẽ cho đáp ứng miễn dịch khác nhau với cùng tmột liều lượng kháng nguyên
Sau những kết quả kiểm tra bằng ELISA ở bước đầu tiên, hai chuột 3.1 và 3.2 được lựa chọn để thu tế bào lympho B dùng cho dung hợp với tế bào Myeloma.
3.2. KẾT QUẢ DUNG HỢP TẠO TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ KHÁNG AFP KHÁNG AFP
Dung hợp tế bào lympho B và tế bào myeloma là quá trình quan trọng trong sản xuất kháng thể đơn dòng. Để quá trình dung hợp tạo tế bào lai diễn ra thuận lợi và đạt kết quả cao cần có 2 loại tế bào chủ yếu là tế bào Meyloma và tế bào lympho B. Ngoài ra cần bổ sung các yếu tố thúc đẩy quá trình dung hợp như: tế bào đại thực bào, PBS, polyethylenglycol (PEG). Trong đó, tế bào đại thực bào sinh Interleukin có tác dụng kích thích tế bào lai phát triển. PEG là một chất có trọng lượng phân tử 4000 Dalton, có tác dụng làm thay đổi màng tế bào để tế bào kết hợp với nhau dễ hơn. FBS là thành phần cung cấp
nhiều chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino axit, tiền chất của axit nucleic, các yếu tố sinh trưởng v.v.
Tế bào Myeloma dòng Sp2/0, P3X: là tế bào ung thư tủy của chuột dòng BALB/c. Ở điều kiện nuôi cấy in vitro thích hợp, tế bào sinh sản và phát triển rất nhanh, có thể đạt nồng độ gấp 5 lần chỉ trong khoảng thời gian 30 giờ. Vì vậy, chúng đòi hỏi nguồn dinh dưỡng lớn từ môi trường. Để có được tế bào Myeloma khỏe mạnh và sẵn sàng cho việc dung hợp tế bào, chúng tôi thấy môi trường có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum) là phù hợp. Và môi trường nuôi cấy cần được tiến hành thay thường xuyên 3 ngày một lần là điều kiện thích hợp cho tế bào.
Tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên AFP: Là những tế bào Lympho B đã mẫn cảm, thu từ lách chuột số 3.1 và 3.2 khi chuột được gây