4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN
3.3. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG
với 9 giếng có giá trị OD cao nhất nằm trong khoảng từ 2,10 đến 2,801 đã được lựa chọn. Các dòng nói trên được nhân nuôi ở cấp độ lớn hơn. Tuy nhiên, trong quá trình nhân nuôi, 5 dòng tế bào lai AFP_2, AFP _1, AFP_5, AFP_6, và AFP_9 đã chứng minh khả năng sinh kháng thể với hiệu suất tốt hơn hẳn 4 dòng còn lại. Vì vậy, 05 dòng trên được lựa chọn nhân nuôi để thu kháng thể đơn dòng nhằm tiếp tục quá trình sàng lọc khi kiểm tra tính đặc hiệu trên các kháng nguyên khác nhau.
3.3. KẾT QUẢ TÁCH DÒNG TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ ĐƠN DÒNG KHÁNG AFP DÒNG KHÁNG AFP
Sau khi kiểm tra bằng ELISA sẽ biết được những giếng nào là có tế bào lai sinh kháng thể. Vì nhận thấy tế bào lai của dòng Sp2/0 có khả năng sinh kháng thể tốt hơn nên chúng tôi chọn lấy các giếng có chứa các tế bào đó để phục vụ cho những bước nghiên cứu tiếp theo.
Trong mỗi giếng mật độ tế bào khá cao, kháng thể sinh ra vẫn là kháng thể đa dòng. Các quần thể tế bào dương tính cần được tách dòng để sản xuất ra một loại kháng thể đặc hiệu. Hơn nữa, việc tách dòng nhanh còn để tách các tế bào dương tính ra khỏi sự phát triển quá mạnh của các tế bào lai không sản xuất kháng thể. Vì vậy cần tiến hành tách dòng để tạo ra các dòng tế bào riêng rẽ sau đó chúng nhân lên và sản xuất kháng thể. Phương pháp thường được sử dụng là tách dòng bằng pha loãng tới hạn.
Với nhận định như trên, chúng tôi chọn giếng A5 của đĩa 5 (lai với dòng Sp2/0) là giếng có giá trị OD cao nhất (OD = 2,35) trong phản ứng
ELISA đồng nghĩa với việc là giếng có tế bào sản xuất kháng thể tốt nhất, pha loãng để đạt được nồng độ là 1tb/100 µl môi trường/giếng. Pha loãng bằng môi trường nuôi cấy, sau đó chia ra 3 đĩa 96 giếng sao cho đạt nồng độ tế bào như mong muốn. Để kiểm tra hiệu quả tách dòng chúng tôi soi trên kính hiển vi, kết quả được tổng hợp ở bảng sau:
Bảng 3.3. Tổng hợp kết quả tách dòng để chọn dòng tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP Số clone/giếng Đĩa thí nghiệm 0 clone/giếng 1 clone/giếng ≥ 2 clone/giếng Đĩa 1 25/96 54/96 17/96 Đĩa 2 22/96 59/96 15/96 Đĩa 3 15/96 62/96 19/96 Tổng số 62/288 175/288 51/288 Hiệu quả 21,53% 60,76% 17,71%
Kết quả tách dòng cho các giếng như sau:
Tổng số giếng không có cụm tế bào nào ở cả 3 đĩa chiếm 21,53% Giếng có hơn 2 cụm tế bào trở lên chiếm 17,71%
Số giếng có 1 cụm tế bào chiếm tỷ lệ cao nhất. Trên đĩa 1 số giếng có một dòng tế bào là 54/96 giếng, ở đĩa 2 là 59/96 giếng, đĩa 3 là 62/96 giếng.
Như vậy trong tổng số 288 giếng thí nghiệm, có 175/288 giếng có 1clone, hiệu quả tách dòng đạt 60,76%.
Hình 3.3. Các cụm tế bào lai (clone) đang phát triển, độ phóng đại 10×20 và 10×10
Sau khi đã xác đinh được các giếng có 1 clone ở mỗi đĩa, tiếp tục nuôi cấy tế bào trong điều kiện phù hợp để các clone có thể nhân lên, phát triển thành một cụm tế bào lớn và sản sinh kháng thể. Trong quá trình nuôi cấy có những tế bào có sức sống yếu không thể phát triển thành cụm tế bào hoặc có thể bị chết.
Để xác định các giếng chứa một dòng tế bào đó có sản sinh kháng thể hay không chúng tôi sử dụng phương pháp ELISA gián tiếp. Trong kỹ thuật sản xuất kháng thể đơn dòng, phương pháp ELISA thường được dùng nhiều vì nó dễ thực hiện, có độ nhạy cao và có thể kiểm tra được một lượng mẫu lớn trong cùng một thời gian.
Thu dịch nổi của môi trường nuôi cấy làm phản ứng ELISA, mỗi giếng được kiểm tra với độ lặp lại là 3 lần sau đó đo OD để ước lượng tương đối lượng kháng thể trong dịch nổi ở mỗi giếng của một dòng tế bào. Giá trị OD phản ánh nồng độ kháng thể có trong dịch nổi. Giá trị OD cao tức là lượng kháng thể nhiều, chứng tỏ dòng tế bào đó có khả năng sản xuất kháng thể tốt và ngược lại.
Trong phản ứng ELISA giếng đối chứng dương chúng tôi sử dụng huyết thanh của chuột số 3.1. Giếng đối chứng âm chỉ sử dụng BSA 1%.
Khi kiểm tra dịch nổi của 175 giếng có 1 clone tế bào duy nhất, chúng tôi nhận thấy chỉ có 30 giếng có kháng thể được sinh ra, thể hiện ở giá trị OD cao hơn đối chứng âm.
Như vậy chỉ có 30 clone tế bào sản xuất kháng thể kháng lại AFP. Đây chính là kháng thể đơn dòng được tạo ra từ 1 tế bào ban đầu mà chúng ta mong muốn. Kết quả tách dòng với 30 giếng có phản ứng dương tính cho thấy sự có mặt của kháng thể kháng AFP được trình bày ở bảng sau:
Bảng 3.4. Giá trị OD của dịch nổi các giếng có 1 dòng tế bào dương tính
Kết quả trên cũng cho thấy:
STT Giếng Đĩa Giá trị OD OD Trung bình Sai số
1 A1 1 1.625 1.651 1.598 1.625 ±0.027 2 A10 1 0.803 0.695 0.739 0.739 ±0.056 3 B3 1 1.378 1.358 1.295 1.344 ±0.043 4 B5 1 0.698 0.669 0.726 0.698 ±0.029 5 B9 1 1.544 1.576 1.503 1.541 ±0.037 6 E2 1 1.207 1.350 1.292 1.283 ±0.072 7 E5 1 2.509 2.516 2.485 2.503 ±0.016 8 E10 1 0.892 0.906 0.885 0.894 ±0.011 9 F2 1 1.246 1.251 1.198 1.232 ±0.029 10 F8 1 2.523 2.562 2.475 2.520 ±0.044 11 G7 1 1.741 1.746 1.693 1.727 ±0.029 12 C2 1 1.152 1.251 1.187 1.197 ±0.050 13 C9 2 0.789 0.694 0.707 0.730 ±0.052 14 A7 2 1.843 1.792 1.852 1.829 ±0.032 15 E7 2 1.597 1.605 1.612 1.605 ±0.008 16 E11 2 1.307 1.278 1.342 1.309 ±0.032 17 F3 2 2.387 2.409 2.456 2.417 ±0.035 18 F6 2 1.463 1.435 1.386 1.428 ±0.039 19 G2 2 2.092 2.125 2.109 2.109 ±0.017 20 G11 2 0.736 0.654 0.708 0.699 ±0.042 21 H1 2 1.059 1.078 1.146 1.094 ±0.046 22 H6 2 0.745 0. 789 0.843 0.794 ±0.069 23 A4 3 1.973 1.852 1.904 1.910 ±0.061 24 A5 3 0.807 0.791 0.826 0.808 ±0.018 25 A9 3 1.734 1.685 1.753 1.724 ±0.035 26 C6 3 2.745 2.721 2.726 2.731 ±0.013 27 C12 3 1.843 1.804 1.751 1.799 ±0.046 28 D5 3 2.619 2.578 2.657 2.618 ±0.039 29 E3 3 0.869 0.876 0.785 0.843 ±0.051 30 E10 3 1,032 1,089 1,030 1.050 ±0.059 ĐC+ 1.831 1.799 1.816 1.815 ±0.016 ĐC- 0.482 0.437 0.454 0.458 ±0.023
Trong các giếng dương tính này, các giếng khác nhau có giá trị OD khác nhau. Điều này chứng tỏ mỗi dòng tế bào khác nhau thì khả năng sinh kháng thể cũng khác nhau.
Có thể thấy các giếng có tế bào lai sinh kháng thể có chất lượng cao phụ thuộc vào dòng tế bào lympho B có đáp ứng miễn dịch tốt với kháng nguyên hay không.
Từ kết quả bảng trên, chúng tôi đã chọn ra 05 dòng tế bào sinh kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu AFP tốt nhất tương ứng với 05 giếng có giá trị OD cao nhất là:
Giếng C6 của đĩa 3 có giá trị OD = 2,731 được đặt tên là dòng AFP-1 Giếng D5 của đĩa 3 có giá trị OD = 2,618 được đặt tên là dòng AFP-2 Giếng F8 của đĩa 1 có giá trị OD = 2,520 được đặt tên là dòng AFP-3 Giếng F3 của đĩa 2 có giá trị OD = 2,417 được đặt tên là dòng AFP-4 Giếng E5 của đĩa 1 có giá trị OD = 2,503 được đặt tên là dòng AFP-5
Với 05 dòng tế bào lai đã chọn lọc AFP - 1,2,3,4,5, chúng tôi tiến hành nhân nuôi in vitro để có số lượng lớn tế bào. Để quá trình nhân nuôi đạt kết quả tốt, từ 05 dòng tế bào được chọn chúng tôi đưa vào 5 chai nuôi cấy sao cho đạt nồng độ 1x105 tế bào/ml. Các chai nuôi cấy được bổ sung môi trường thích hợp cho các tế bào lai phát triển tốt và nuôi trong tủ ấm 370C, 5%CO2. Môi trường nuôi cấy chúng tôi sử dụng gồm các thành phần: DMEM bổ sung FBS 10%.
Việc tiếp theo cần làm là kiểm tra độ đặc hiệu của kháng thể đơn dòng thu được từ các dòng tế bào ở trên.
Để kiểm tra độ đặc hiệu của các dòng tế bào này đối với dấu ấn ung thư AFP, chúng tôi sử dụng thêm các chất có bản chất là protein, có đầy đủ điều kiện để trở thành kháng nguyên gồm dấu ấn ung thư của tế bào ung thư như CEA (Carcinogen A). Kháng thể đơn dòng đặc hiệu với kháng nguyên sẽ chỉ kết hợp với kháng nguyên đã kích thích sinh ra nó mà không kết hợp với một kháng nguyên nào khác. Từ đó có thể đưa ra kết luận kháng thể đơn dòng tạo ra có đặc hiệu với kháng nguyên cần xác định hay không. Vì thế, dịch nổi nuôi cấy 5 dòng tế bào nói trên sẽ được thu nhận và kiểm tra tính đặc hiệu bằng phản ứng ELISA đối với các kháng nguyên khác nhau đã được đề cập ở trên. Dịch nổi của dòng tế bào nào chỉ dương tính với kháng nguyên AFP sẽ cho thấy dòng tế bào đó sản sinh kháng thể đơn dòng kháng đặc hiệu với AFP mà chúng ta mong muốn.
Dịch nổi của 5 dòng tế bào này đóng vai trò là kháng thể 1 trong phản ứng ELISA gián tiếp. Dịch nổi của các dòng AFP-1, 2, 3, 4, 5 đươc chúng tôi ủ với từng loại kháng nguyên khác nhau. Giếng đối chứng âm chỉ cho BSA 1% và coating buffer. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5
Bảng 3.5. Kiểm tra độ đặc hiệu của dịch nổi của các dòng tế bào
Kháng nguyên Dòng tế bào
PSA AFP BSA CEA
AFP _1 + + + +
AFP _2 - + - -
AFP _3 + + - -
AFP _4 - + + -
AFP _5 - + - +
BSA 1% (đối chứng âm) - - - -
Kết quả trên cho thấy:
Dòng AFP-1 cho kết quả dương tính với tất cả các kháng nguyên kiểm tra. Như vậy, dòng AFP-1 cho kháng thể không đặc hiệu với kháng nguyên AFP mà chúng ta mong muốn.
Dòng AFP-2 cho kết quả dương tính với kháng nguyên AFP và âm tính với các kháng nguyên đem thử còn lại.
Dòng AFP-3 cho kết quả dương tính với kháng nguyên PSA và AFP. Như vậy, kháng nguyên do dòng tế bào này sinh ra có khả năng kết hợp với cả hai loại kháng nguyên đó. Như vậy dòng AFP-3 có tính đặc hiệu không cao.
Dòng AFP-4 cũng cho kết quả dương tính với kháng nguyên AFP và BSA, âm tính với hai kháng nguyên còn lại. Dòng tế bào này cũng có tính đặc hiệu không cao.
Dòng AFP-5 cho kết quả dương tính vớí hai kháng nguyên là AFP và CEA. Dòng tế bào này cũng có tính đặc hiệu không cao.
Như vậy trong 5 dòng tế bào có hoạt tính cao, khả năng sinh kháng thể tốt nhất đem thử chỉ có duy nhất dòng AFP-2 tạo ra kháng thể có tính đặc
kiểm tra. Dòng tế bào này được chúng tôi thu nhận và đưa ra nuôi cấy ở qui mô lớn để thu nhận kháng thể đơn dòng và lưu giữ lâu dài trong nitơ lỏng.