4. Ý NGHĨA THỰC TIỄN
3.2. KẾT QUẢ DUNG HỢP TẠO TẾ BÀO LAI SINH KHÁNG THỂ KHÁNG AFP
KHÁNG AFP
Dung hợp tế bào lympho B và tế bào myeloma là quá trình quan trọng trong sản xuất kháng thể đơn dòng. Để quá trình dung hợp tạo tế bào lai diễn ra thuận lợi và đạt kết quả cao cần có 2 loại tế bào chủ yếu là tế bào Meyloma và tế bào lympho B. Ngoài ra cần bổ sung các yếu tố thúc đẩy quá trình dung hợp như: tế bào đại thực bào, PBS, polyethylenglycol (PEG). Trong đó, tế bào đại thực bào sinh Interleukin có tác dụng kích thích tế bào lai phát triển. PEG là một chất có trọng lượng phân tử 4000 Dalton, có tác dụng làm thay đổi màng tế bào để tế bào kết hợp với nhau dễ hơn. FBS là thành phần cung cấp
nhiều chất dinh dưỡng quan trọng cho tế bào như các amino axit, tiền chất của axit nucleic, các yếu tố sinh trưởng v.v.
Tế bào Myeloma dòng Sp2/0, P3X: là tế bào ung thư tủy của chuột dòng BALB/c. Ở điều kiện nuôi cấy in vitro thích hợp, tế bào sinh sản và phát triển rất nhanh, có thể đạt nồng độ gấp 5 lần chỉ trong khoảng thời gian 30 giờ. Vì vậy, chúng đòi hỏi nguồn dinh dưỡng lớn từ môi trường. Để có được tế bào Myeloma khỏe mạnh và sẵn sàng cho việc dung hợp tế bào, chúng tôi thấy môi trường có bổ sung 10% FBS (Fetal Bovine Serum) là phù hợp. Và môi trường nuôi cấy cần được tiến hành thay thường xuyên 3 ngày một lần là điều kiện thích hợp cho tế bào.
Tế bào lympho B mẫn cảm kháng nguyên AFP: Là những tế bào Lympho B đã mẫn cảm, thu từ lách chuột số 3.1 và 3.2 khi chuột được gây miễn dịch bằng kháng nguyên AFP với liều 5 µg AFP/con/lần. Tế bào lympho B sau khi thu được của mỗi chuột đem chia làm 2 phần theo đó 1 phần đem lai với tế bào Sp2/0, 1 phần đem lai với tế bào P3X. Chúng tôi sử dụng 3 đĩa 96 giếng để lai tế bào lympho B với mỗi loại tế bào Myeloma nên sẽ có tổng là 6 đĩa
Dung hợp tế bào lai được thực hiện theo quy trình như đã trình bày ở phương pháp. Tế bào sau dung hợp được nuôi trên 6 đĩa nhựa 96 giếng của Corning (tổng số là 576 giếng). Sau 5- 7 ngày dung hợp, chúng tôi tiến hành sàng lọc tế bào bằng môi trường chọn lọc HAT và HT để thu được tế bào lai (Hybrioma). Vì thế, tế bào Myeloma không có enzyme HPRT (Hypoxanthin – phospho – ribosyl – transferase) dẫn đến không tổng hợp được ADN. Vì vậy, khi môi trường có HAT và HT, tế bào myeloma sẽ không tổng hợp được ADN do bazơ cung cấp cho quá trình tổng hợp ADN ở dạng liên kết nên đòi hỏi phải có enzyme để thủy phẩn liên kết này. Như thế, tế bào myeloma sẽ chết sau vài ngày. Tế bào lympho B vẫn phát triển bình thường trong môi trường HAT do nó có enzyme HPRT nhưng tế bào lympho B cũng chết sau 1-2 ngày vì không tiếp tục sinh sản. Do đó, chỉ các tế bào lai (vì nó có một mặt tiếp thu khả năng sinh sản của tế bào myeloma, một mặt nó tiếp thu được enzyme HPRT của tế bào lympho B).
Hình 3.2. Tế bào Lympho B và tế bào Sp2/0 dung hợp và phát triển trên nền tế bào feeder, độ phóng đại 10×20
Sau 15 ngày nuôi cấy (sau khi dung hợp và đã chọn lọc bằng môi trường HAT và HT), chúng tôi tiến hành kiểm tra toàn bộ số giếng dưới kính hiển vi soi ngược với độ phóng đại 10 x 20 và đánh dấu những giếng có tế bào lai. Tiếp theo, các giếng có tế bào lai được thu nhận dịch nổi để kiểm tra sự có
mặt của kháng thể kháng AFP bằng phương pháp ELISA gián tiếp. Kết quả thu được về tỷ lệ giếng có tế bào lai dương tính trên tổng số giếng thu được về tế bào lympho B của chuột với 2 dòng tế bào Sp2/0 và P3X được trình bày tóm tắt ở bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả dung hợp tạo tế bào lai sinh kháng thể đơn dòng kháng AFP trên 2 dòng tế bào myeloma
Chuột Chuột số 3.1 Chuột số 3.2 Tổng số
Các chỉ số thí nghiệm P3X Sp 2/0 P3X Sp2/0 P3X Sp2/0 Số giếng thực hiện
dung hợp tế bào 144 144 144 144 288 288
Số giếng có tế bào lai 89 103 94 107 183 210 Tỷ lệ % giếng có tế bào lai 61,81 % 71,53 % 65,28 % 74,31 % 63,54 % 72,92% Số giếng có kháng thể 67 76 74 81 141 157 Tỷ lệ % giếng có tế bào lai sinh kháng
thể 46,53 % 52,78 % 53,39 % 56,25 % 48,96 % 54,51% Kết quả từ bảng trên cho thấy cả hai chuột khi lai với dòng Sp2/0 đều cho hiệu quả lai cao hơn, tỷ lệ phần trăm số giếng có tế bào lai lần lượt là 74,34% và 71,53% so với tỷ lệ số giếng có tế bào lai của dòng P3X là 61,81% và 65,28%.
Sau khi thu dịch nổi và kiểm tra bằng phản ứng ELISA, chúng tôi nhận thấy trong số các giếng có kết quả dương tính với AFP, tỷ lệ số giếng có tế bào lai sinh kháng thể của dòng Sp2/0 cũng cao hơn so với dòng P3X. Trong tổng số 288 giếng thí nghiệm của mỗi dòng tế bào, số giếng có tế bào lai sinh kháng thể của dòng Sp2/0 chiếm 54,51% còn dòng P3X chỉ chiếm 48,96%. Từ đó ta có thể rút ra kết luận dòng tế bào u tuỷ Sp2/0 cho hiệu quả lai cao
Từ kết quả kiểm tra ELISA, giếng có giá trị OD cao nhất được lựa chọn để thu nhận, làm sạch dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn. Sau khi tiến hành tách dòng bằng phương pháp pha loãng tới hạn, 09 dòng tế bào lai sinh