Sản xuấât dung dịch đường dextrose có nồng độ cao

c. B Licheniformis α-amylase

4.3. Sản xuấât dung dịch đường dextrose có nồng độ cao

4.3.1.. Lời giới thiệu

Glucoamylase [EC 3.2.1.3, α(1,4)-glucan glucohydrolase], mặc dù sự tương đồng của

cả tên thông thường và tên hệ thống của các α-amylase, chúng bao gồm nhiều loại

enzyme khác nhau. α-amylase là một endolydrolase tác động lên các liên kết α(1,4)

glucosidic bên trong của các phân tử amylose và amylopectin, nhưng glucoamylase

phân cắt các nối α(1,4) đặc biệt tại các đầu không khử (nonreducing) của cả tinh bột

và các đoạn từ sự thủy phân bởi α-amylase. Tuy nhiên, tương tự như α-amylase, nó có

hoạt tính mạnh trên các chuỗi dài hơn chuỗi ngắn. Ngoài ra, glucoamylase còn có khả

năng thủy phân liên kết α(1,6)

Khi công nghệ enzyme được quan tâm, glucoamylase còn khá mới mẻ, vừa chỉ được

khám phá hơn 30 năm. Vì thế nó chưa thông dụng. Tuy nhiên tính đặc trưng của nó thì

rất lớn và các sản phẩm glucose của nó thì rất vượt trội cạnh tranh rất mạnh mẽ với

sản phẩm được thủy phân bằng acid và nhanh chóng thích hợp với sản xuất dung dịch

đường glucose nồng độ cao.

Kiểu

enzyme ^{Nguồn enzyme Tên gọi}

% Tinh bột bị thủy phân Hoạt lực mantase Rhizopus

delemar ^Rh.delemar Rh. delemar Asp. awamori Asp. niger - - Glucoamylase Glucoamylase Amylase “deebraanding” Amyloglucosidase Glucoamylase Amyloglucosidase 92 100 100 100 100 100 + + + + + Aspergillus

niger ^Asp.usamii Rh.tonkinensis Asp.niger Asp.niger Asp.oryzae Asp.awamori Neurospora Monaseus γ-amylase “glucogenase” Amyloglucosidase Amyloglucosidase Taka-amylase Amylase-sacarogenase Amyloglucosidase amyloglucosidase 70 80 80 78 75 80 75 74 - + + + + + + +p

Glucoamylase được sản xuất bởi số lượng lớn của nấm và các loài động vật; tuy nhiên

chỉ các glucoamylase của Aspegillus và Rhizopus là các chế phẩm thương mại. Khi

enzyme được lựa chọn tại Mỹ, nơi mà phần lớn các loại glucoamylase được dùng các

tính chất của Apergillus enzyme, và đặc biệt từ Aspergillus niger, sẽ được thảo luận

sau đây.

4.3.2. Tính chất phân tử của glucoamylase

phải hiểu một số chi tiết về tính chất phân tử và động lực học của nó. Nhiều chủng

A.niger tạo ra hai glucoamylase isoenzyme chính. Và thông thường thấy cả hai trong

các chế phẩm thương mại (commercial preparation). Glucoamylase I có điểm đẳng

điện thấp hơn và được tách ra thứ hai trong cột sắc ký chứa DEAE-cellulose khi một

gradient pH giảm được áp đặt. Hai isoenzyme khác nhau về chiều dài, glucoamylase I

có 616 amino acid với phân tử lượng 66,000 (82,000 khi kết hợp với carbonhydrate)

trong khi glucoamylase II có cùng trình tự amino acid nhưng thiếu một mảnh C cuối

cùng. Glucoamylase I có nhiều serine, threonine, aspartic acid, alanine, và glycine,

có ít methionine, histidine, cysteine, lysine, và arginine. Mannose, glucose và

galactose được nối chủ yếu với serine, và threonine trong một vùng của 70 amino

acid. Glucoamylase I ổn định gấp 4 lần glucoamylase II; việc loại bỏ carbonhydrate

làm giảm cả hoạt tính và sự ổn định.

C. Đặc tính của glucoamylase

Như đã được nói trên, glucoamylase tấn công di-, oligo-, và polysaccharide

chứa glucose, đặc biệt khi nằm giữa liên kết α(1,4). Glucoamylase cũng tấn công liên

kết bởi α(1,6) với tỉ lệ thấp hơn. Các đoạn bị đứt là của các nối glucosic liên kết

anomeric carbon của glucose cuối cùng tại đầu không khử của chuỗi với oxygen, β-

glucose mềm dẻo và một mảnh chứa nó ít đơn vị hơn chuỗi ban đầu. Cấu trúc này của

anomeric carbon bị thay đổi là sự biểu lộ khác mà glucoamylase là một exo-hydrolase

hơn là một glycoside glycohrolase; tuy nhiên nó không phải là một đặc tính công

nghiệp, khi sự biến đổi luân phiên là quá nhanh dưới các điều kiện sản xuất công

nghiệp để cho các phản ứng thành công, như là với glucose isomerase, đặc hiệu cho

α-glucose, sự chạm trán là một hỗn hợp cân bằng của α- và β-glucose.

Tốc độ phản ứng gia tăng khi tăng chiều dài chuỗi với khoảng 5 đơn vị, tại đó

tốc độ là khoảng 5 lần hơn so với maltose. Điều này cho thấy rõ glucoamylase có sự

thu hút cao với các chuỗi dài hơn, để không chỉ làm tốc độ gia tăng mà còn làm hằng

số Michelis giảm. Hiromi và nhóm của mình giải thích các hiện tượng này được gây

ra bởi trung tâm hoạt động của phân tử glucoamylase chứa một số vị thay thế có khả

năng bắt giữ glucose; một số chất nền có thể có thể cho phép gia tăng xác xuất hình

thành phức enzyme và cơ chất. Sản xuất glucose từ đầu không khử của chuỗi hơn là

sản xuất các đoạn lớn hơn hay sự phân cắt chuỗi, xảy ra khi vị trí phân cắt của

enzyme nằm giữa vị trí thay thế đầu tiên và thứ hai.

Mặc dù sự tấn công đầu tiên là từ các liên kết α(1,4) glucosic, glucoamylase

cũng có hoạt tính tại α(1,3) và, sử dụng cùng trung tâm hoạt động. Đó là hoạt tính

khoa học thú vị trong công nghệ, sau khi α-amylase xử lý các liên kết α(1,6) cái mà

phải được phân cắt nếu hiệu suất glucose có thể chấp nhận đạt được. Nigerose (3-α-

D-glucopyranosyl-D-glucose) và isomaltose (6-α-D-glucopyranosyl-D-glucose) bị

thủy phân khoảng 1% và tỉ lệ khoảng 1-4% trên maltose, một cách tuần tự. Các chuỗi

dài chứa các nối α(1,3) bị bẽ gãy với cùng tỉ lệ của Nigerose. Với các nối α(1,6), một

sự gia tăng chiều dài chuỗi sẽ làm tăng tỉ lệ thủy phân. Các đoạn chứa hỗn hợp các

nối α(1,3), α(1,4), α(1,6), mà một vài trong số chúng có thể được hình thành trong

suốt quá trình thủy phân tinh bột và dextrin bằng α-amylase và β-amylase, được phân

cắt bằng các tỉ lệ rất khác nhau sau đó. Ví dụ, nối α(1,4) trong isopanose (I) bị bẽ gãy

gấp 2-3 lần, trong 3-α-maltosylglucose (II) gấp 1-2 lần và trong 3-α-

maltotriosylglucose (III) gấp 5 lần tỉ lệ của maltose (các đường nằm ngang trong hình

minh họa đại diện cho liên kết α(1,4), các đường nằm ngang là α(1,6), các đường nằm

chéo là α(1,3), các vòng tròn là glucose và các vòng tròn có gạch chéo là các glucose

khử)

Ba loại liên kết này, cùng với 6

-α-maltosylmaltose (IV), tạo ra đoạn chứa một

liên kết α(1,3) hay α(1,6), liên kết α(1,4) tại đầu không khử bị bẽ gãy, và các đoạn

này còn lại trừ khi quá trình thủy phân kéo dài thêm. Nói một cách khác, sự tồn tại

của một liên kết α(1,3) hay α(1,6) tại đầu không khử, như panose (V) và 6

-α-

glucosylmaltotriose (VI), tạo ra glucose rất nhanh khi các nối này bị phân cắt. Có thể

hy vọng rằng khi số lượng của liên kết α(1,4) trong chất nền gia tăng, ngay cả khi

chất nền có các kiểu nối khác, hiệu suất của quá trình thủy phân sẽ gia tăng, như đã

được ghi nhận bởi sự gia tăng trong hiệu suất thủy phân của III trên II cũng tốt như V

trên maltose. Ngay cả khi thêm vào một glucose được liên kết bởi nhiều hơn một

α(1,4) có thể làm tăng hiệu suất thủy phân, nối trong cả I và II bị bẽ gãy nhanh hơn là

là chúng có trong maltose. Yếu tố này làm tăng sản phẩm từ thủy phân bởi a-

amylase của amylopectin chứa các liên kết α(1,6) rất nhạy cảm khi bị bẽ gãy bởi

glucoamylase với một hiệu suất tối thiểu có thể chấp nhận được.