c. B Licheniformis α-amylase
4.3.3. Động lực học và sự cân bằng trong phản ứng ngược
Phải nhất trí rằng glucoamylase tinh khiết, không có các enzyme khác, có thể thủy
phân α(1,6) và α(1,3), cũng tốt như liên kết α(1,4), nhưng ngược lại, glucoamylase có
thể tạo ra các nối này thì không được coi là tốt. Tuy nhiên, khái niệm về sự đảo chiều
cực nhỏ mới được chấp nhận gần đây và được xem như một sự cân bằng.
Có một vài dữ kiện về hiệu suất hình thành các nối này và các giá trị cân bằng của
các kiểu kết quả, có được với các mẫu xem như đồng nhất tương đối, hay tại
transferase-free tối thiểu, của glucoamylase.
Rhizopus niveus glucoamylase tại 55
oC và khoảng chừng pH 5 tạo ra 96%
glucose, 1.3% nigerose và maltose, 2.2% isomaltose, và 0.5% oligosaccharide, hầu
hết isomaltose và panose trên nền tảng khô trong 96 giờ từ dung dịch ban đầu chứa
khoảng 40% (w/v)glucose. Với Endomyces glucoamylase với cùng điều kiện, 3.1%
isomaltose, 1.5% nigerose và maltose, 0.5% oligosaccharide, chủ yếu là
isomaltotriose, panose, và maltotriose được hình thành. Một cách không rõ ràng là sự
cân bằng có đạt được trong trường này hay không.
Hehre et al., dùng R.niveus glucoamylase thuần khiết tại 30
oC và pH4.5, tìm
thấy rằng chỉ β-glucose sẽ bắt đầu phản ứng đảo ngược, điều được mong đợi, khi nó
là sản phẩm của phản ứng thủy phân được xúc tác bởi glucoamylase. Có sự tổng hợp
maltose nhanh chóng nhưng bị giới hạn, sự hình thành của isomaltose thì chậm nhưng
nhiều, và sự sản xuất nigerose và oligosaccharide trong 24 giờ thì chậm và bị giới
hạn. Khi maltose là chất nền dưới cùng điều kiện trong một thí nghiệm 15 phút,
maltotriose và panose, không có isomaltose được tìm thấy cùng với glucose. Một hằng
số cân bằng cho maltose đã được xác định:
[maltose].[H
2O]
K
Maltose =Paxur et al., bằng A.niger glucoamylase được tinh sạch bằng DEAE-cellulose,
nhưng không ghi rõ loại isoenzyme nào, nhận thấy rằng 30% (w/w) glucose tại pH3.5
và nhiệt độ phòng tạo ra hơn 1% sự đảo ngược thành mỗi nigerose và isomaltose sau
96 giờ, sản phẩm được hình thành rất nhanh. Không có sự hình thành maltose. Với
khoảng 30% (w/v) maltose tại pH 4.8 và nhiệt độ phòng, 1.3% chất nền sẽ tạo thành
isomaltose và 0.7% thành panose sau 24 giờ, một số lớn chuyển thành glucose. Trong
trường hợp khác, đạt được sự cân bằng.
Roels and van Tilburg, sử dụng A.niger glucoamylase thương mại, nhiều free
of transferase, nhưng hầu như chứa cả 2 loại isoenzyme, đo lường sự cân bằng và
động lực học của sự đảo ngược glucose và của phản ứng thủy phân DE 15 dextrin tại
pH4.5 với các nồng độ khác nhau (10-40%) và các nhiệt độ khác nhau (45-65
oC). Sự
cân bằng của maltose và isomaltose là không đáng kể với chất nền hay với nhiệt độ.
Cần phải thừa nhận rằng tại các điều kiện này β-glucopyranose chiếm 63% tổng số
glucose, đó là:
[maltose].[H
2O]
K
maltose= = 0.45
[β-glucopyranose].[glucose]
[isomaltose].[H
2O]
K
maltose= = 2.6
[β-glucopyranose].[glucose]
Sự có mặt của nigerose và oligosaccharide không được ghi nhận.
Động lực học của sự hình thành maltose và isomaltose từ glucose được mô
hình bằng việc dùng giới hạn thứ hai (second-order terms) và hằng số cân bằng vừa
thu được và các dữ liệu thí nghiệm phù hợp có liên quan. Gia tăng nhiệt độ và nồng
độ glucose làm tăng hiệu suất hình thành maltose và isomaltose, maltose được hình
thành nhanh nhưng ở mức độ thấp hơn isomaltose.
Bài thuyết trình thứ hai từ cùng phòng thí nghiệm cho thấy nhiều mô hình hoàn
chỉnh cho sự cân bằng giữa glucose và di-, oligosaccharide chứa liên kết α(1,4) và
α(1,6) và từ các ghi nhận trước đó rằng enthalpy tự do của sự thủy phân maltose tại
60
oC và đơn vị nồng độ của phản ứng là -3500 J/mol, nhưng đơn vị nồng độ của phản
ứng của isomaltose là
1400 J/mol.
chuyển đổi là khi glucoamylase thủy phân dextrin.
Lee et al. sử dụng glucoamylase cố định và tan được để bẻ gãy các dextrin của
các DE khác nhau tại các nhiệt độ khác nhau. Với DE ban đầu thấp, sẽ đạt được DE
cao tối đa do bởi giảm số lượng các sản phẩm phụ được hình thành khi tinh bột bị thủy
phân các dextrin DE thấp. Các disaccharide bắt đầu gia tăng trước khi DE tối đa được
đạt đến cùng lúc với sự tăng chậm các trisaccharide. Việc gia tăng nhiệt độ làm giảm
nhẹ DE tối đa, nhưng nó làm tăng tốc độ thủy phân và sự tích lũy đột ngột các sản
phẩm phụ.
Thật không dễ để nhất trí với các phát hiện khác nhau này. Roels và van
Tilburg không tìm ra nigerose bằng các phương pháp mà họ sử dụng, sắc ký lỏng cao
áp (HPLC) với cột Waters carbonhydrate không đủ khả năng để tách nigerose khỏi
maltose. Họ đã tìm ra các oligosaccharide nhưng không báo cáo chúng. Sự vắng mặt
của maltose trong báo cáo của Pazur et al. có thể bị tạo thành bởi pH thấp (pH3.5), so
sánh với pH 4.5~5.0. Khi isomaltose được hình thành một cách chậm chạp từ glucose.
Hehre et al. có thể tìm ra chúng trong thí nghiệm 15 phút mà sử dụng maltose như một
cơ chất bởi vì không đủ thời gian để nó được hình thành.
Nếu hằng số cân bằng được báo cáo bởi Roels và van Tilburg là bất biến khi
nhiệt độ hạ xuống 30
oC được thực hiện bởi Hehre et al. một nồng độ maltose cho kết
quả rằng là 3 lần lớn hơn đạt được với hằng số cân bằng gần đây nhất. Điều này cho
thấy rằng tất cả maltose và nigerose bởi các vấn đề trước đã tạo ra các sai lầm đáng
kể.
Dữ liệu cân bằng của Hehre et al. về sự hình thành của maltose và nước từ
glucose và β-glucose dẫn tới một năng lượng tự do tiêu chuẩn 5000 J/mol. Điều này
rất gần gũi với enthalpy chuẩn cho sự hình thành maltose và nước từ glucose (4585
J/mol tại 25
oC và 4750 J/mol tại 35
oC) và enthalpy chuẩn để hình thành 1 liên kết
trung bình α(1,4) trong amylose (4300 J/mol).
Như đã đề cập trước đó, van Beynum et al năng lượng tự do tiêu chuẩn của
thủy phân isomaltose thành glucose là 1400 J/mol. Isomaltose và nước từ β-glucose và
glucose thì năng lượng tự do là -2650 J/mol. Đó là khoảng enthalpy chuẩn để hình
thành α(1,4) trong isomaltose (-5430 J/mol) hay hình thành liên kết này trong panose
(-5180 J/mol) và giá trị gần tới zero bởi sự thiếu nhiệt độ phụ thuộc được tìm ra cho
phản ứng bởi Roels va van Tilburg.
Như đã lưu ý, một trong các khó khăn trong nghiên cứu các phản ứng ngược là
sự bất lực của các phương pháp sắc ký thông dụng để có thể phân tách disaccharide,
maltose, nigerose; rõ ràng, vấn đề với trisaccharide và các phân tử lớn hơn là khó
khăn. Sự khó khăn này là hiển nhiên đối với cả Watanabe et al. và Roels và van
Tiburg, và cả Pazur et al. Sự tiến bộđgần đây nhất bở Nikolov và Reilly hứa hẹn cho
phép có được độ chính xác cao trong việc đo lường maltose, nigerose, và isomaltose
với các nồng độ khác nhau. Họ có thể phân tách hoàn toàn 6 loại anomeric của 3
disaccharide, sau trimethylsilylation, bằng sắc ký lỏng-khí (GLC) ở 240
oC bởi cột
mao quản silica SE-54.
Một phần của tài liệu
HỆ AMYLASE VÀ ỨNG DỤNG TRONG CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM
(Trang 50 -55 )