ECL là một quá trình xảy ra với nhiều phân tử như ruthenium, osmium, rhenium và các thành phần khác. Trong quá trình này, các phản ứng hóa học xảy ra
M t s ph c h p trong h n h p đ c truy n t i l i s i th y tinh Các kháng th kháng‐kháng ch t phân tích đã đánh d u ALP k t h p v i ph c h p vi h t. C ch t MUP đ c đ a vào l i. S n ph m phát huỳnh quang là MU đ c đo l ng.
trên bề mặt của một điện cực tạo ra một số chất từ tiền chất ổn định. Các chất mới tạo ra này phản ứng với nhau để phát ánh sáng. Sự phát triển của kỹ thuật ECL dựa
trên cơ sở sử dụng phức chất ruthenium(II)-tris(bipyridyl) [Ru(bpy)3] 2+ và
tripropylamine (TPA). Sản phẩm của phản ứng quang hóa cuối cùng được thu nhận bằng cảm biến ánh sáng.
Phức chất ruthenium khi bị kích thích điện tạo điều kiện cho các phản ứng
quang hóa và tạo ra ánh sáng. Quá trình bắt đầu khi một điện áp được đặt vào điện cực tạo ra điện trường tác động lên các phức hợp miễn dịch (bao gồm cả phức hợp
ruthenium) đã được gắn vào các vi hạt phủ streptavidin. Ưu điểm của việc kích
thích phản ứng quang hóa bằng điện là có thể điều khiển chính xác toàn bộ quá
trình.
Phản ứng ECL trên bề mặt điện cực
Hình 2.21. Phát hiện phức hợp miễn dich đánh dấu ruthenium
Hai hoạt chất là phức hợp ruthenium và TPA bị kích thích điện để phản ứng tạo ra ánh sáng. Cả hai chất này đều giữ nguyên trạng thái ổn định khi chưa có điện áp tác động.
vào tạo ra điện trường kích thích các chất nằm trong đó phản ứng. TPA bị oxi hóa tại điện cực giải phóng ra các điện tử và tạo ra gốc cation TPA trung gian, rồi sau đó
tiếp tục phản ứng giải phóng ra proton H+ để tạo ra gốc TPA*.
Trong khi đó, phức hợp ruthenium cũng giải phóng ra các điện tử ở bề mặt điện cực do quá trình oxi hóa để tạo thành cation Ru(bpy)33+. Cation này là thành phần phản ứng thứ cấp cho phản ứng quang hóa xảy ra sau đó với gốc TPA.
Hình 2.22. Phản ứng ECL ở bề mặt điện cực
TPA* và Ru(bpy)33+ phản ứng với nhau làm cho Ru(bpy)33+ chuyển thành
Ru(bpy)32+ đồng thời tạo ra một trạng thái kích thích do bị truyền năng lượng. Trạng
thái kích thích này không ổn định và nhanh chóng bị phân rã để trở về trạng thái ban đầu bằng cách giải có bước phóng ra các photon sóng 620nm. Chu trình phản ứng sau đó lại được bắt đầu. Quá trình quang hóa này không bị ảnh hưởng bởi các gốc TPA trung gian. Do TPA được sử dụng tối đa nên cần có số lượng lớn. Phản ứng được điều khiển theo sự khuếch tán của TPA và số phức hợp ruthenium. Trong điện trường, TPA bị giảm đi nên cường độ tín hiệu (độ sáng) giảm chậm sau khi đạt tới giá trị cực đại.
Vì TPA bị giảm trong quá trình đo nên phức hợp ruthenium ở trạng thái gốc được tái tạo liên tục. Điều này có nghĩa là phức hợp ruthenium có thể thực hiện
chính xác cho kỹ thuật ECL. Nhiều photon có thể được tạo từ một phức hợp kháng nguyên – kháng thể.
Tạo tín hiệu ECL
Hình vẽ dưới đây minh họa cho quá trình tạo tín hiệu ECL. Theo quan điểm điện tử, phản ứng được giải thích như sau: khi một điện áp cấp vào điện cực của buồng đo sẽ xuất hiện một ánh sáng được coi như một tín hiệu ECL.
Hình 2.23. Tạo tín hiệu ECL
Vùng nằm dưới đường cong đo được trong khoảng giới hạn cường độ tối đa.
Đường chấm cho biết điện áp đặt vào điện cực để tạo ra tín hiệu ECL. Đường nét liền cho biết ánh sáng thực ở đầu ra được đo bằng cảm biến nhân quang.
Quá trình đo ECL gồm các bước sau:
‐ Tách hạt gắn kết/tự do: bằng một nam châm, các vi hạt có streptavidin bị bao
phủ bởi các phức hợp miễn dịch bị hút lên bề mặt điện cực hoạt động. Bộ
đệm hệ thống được sử dụng để rửa các hạt trên điện cực hoạt động và rửa trôi hết thuốc thử thừa ra cũng như mẫu từ buồng đo.
‐ Phản ứng ECL: nam châm được lấy đi, cấp điện áp vào điện cực hoạt động.
được đo bằng ống nhân quang.
Hình 2.24. Cấu trúc buồng đo ECL
A.Các vi hạt từ tính B. Ống nhân quang
C.Điện cực đếm D.Kháng thể không gắn kết
E. Kênh dẫn F. Nam châm
G.Điện cực làm việc
‐ Giải phóng vi hạt và làm sạch buồng đo: sau khi quá trình đo lường hoàn
thành, các vi hạt thuận từ được rửa sạch khỏi bề mặt điện cực bằng dung dịch đặc biệt. Bề mặt buồng đo được khôi phục bằng cách thay đổi điện thế trên điện cực. Buồng đo lúc này sẵn sàng cho một quá trình mới.
Các thể thức dùng trong kỹ thuật ECL gồm có thể thức cạnh tranh, thể thức sandwich và thể thức bắc cầu.