FPIA là một loại xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh đồng nhất. Với tính chất gắn kết cạnh tranh, kháng nguyên của mẫu và thuốc thử đánh dấu AgF cạnh tranh nhau để có được vị trí gắn kết với kháng thể. Vì là xét nghiệm miễn dịch đồng nhất nên phản ứng được thực hiện trong một dung dịch duy nhất và phức hợp Ab – AgF không cần qua bước rửa để tách nó từ AgF tự do.
Hình 2.15. Xét nghiệm miễn dịch phân cực huỳnh quang cạnh tranh
FPIA được sử dụng để xác định chính xác và nhạy với chất phân tích là các
độc chất nồng độ thấp như thuốc điều trị, thuốc bị lạm dụng, chất độc và một số hoocmon. Thuốc thử FPIA gồm các thành phần sau:
S – thuốc thử kháng thể: huyết thanh miễn dịch để phân tích T - chất đánh dấu: chất phân tích đánh dấu phát sáng
P - chất rửa tiền xử lý: tạo điều kiện thuận lợi tách thuốc ra khỏi
protein huyết thanh.
FPIA sử dụng ba yếu tố căn bản để đo lường chất phân tích theo thể thức đồng nhất: huỳnh quang, quay các phân tử trong dung dịch và ánh sáng phân cực.
‐ Huỳnh quang: là chất đánh dấu phát sáng hấp thụ năng lượng ánh sáng ở bước
sóng 490nm và giải phóng năng lượng này ở bước sóng lớn hơn (520nm) dưới dạng ánh sáng huỳnh quang.
Hình 2.16. Phát hiện huỳnh quang trong liên hợp phức huỳnh quang
‐ Quay các phân tử trong dung dịch: Trong một dung dịch, các phân tử lớn quay
chậm hơn các phân tử nhỏ. Nguyên lý này được sử dụng để phân biệt phân tử kháng nguyên đánh dấu AgF nhỏ hơn quay nhanh hơn với phức hợp Ab – AgF lớn hơn quay chậm trong dung dịch.
‐ Ánh sáng phân cực: Kỹ thuật phân cực huỳnh quang phân biệt AgF với liên hợp
phức Ab-AgF thông qua đặc điểm phân cực ánh sáng khác nhau của chúng khi được chiếu sáng phân cực. Ánh sáng phân cực chỉ xuất hiện trên một không gian phẳng. Khi ánh sáng phân cực bị hấp thụ bởi phân tử AgF nhỏ hơn thì phân tử này có khả năng xoay vị trí của nó trong dung dịch nhanh chóng trước khi ánh sáng huỳnh quang được phát ra. Ánh sáng giải phóng ra phát tới một mặt phẳng không gian khác nên được gọi là ánh sáng phân cực. Phức hợp Ab- AgF kích thước lớn hơn không xoay nhanh trong dung dịch nên ánh sáng được giải phóng ra vẫn nằm trên mặt phẳng không gian ban đầu. Một cảm biến sẽ thu nhận để đo lường ánh sáng này.
Hình 2.17. Đo lường phức hợp kích thước lớn bằng ánh sáng, quay và ánh sáng phân cực trong kỹ thuật FPIA
Hình 2.18. Phức hợp kích thước nhỏ hơn sẽ cho cường độ sáng thấp hơn