2.4.1. Các kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch ban đầu 2.4.1.1. Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch RIA
Xét nghiệm miễn dịch bắt đầu được phát triển vào những năm 1960 với
phương pháp xét nghiệm miễn dịch phóng xạ (RIA). Phương pháp này sử dụng các đồng vị phóng xạ làm chất đánh dấu và lượng phóng xạ đo được sẽ cho biết lượng chất phân tích có trong mẫu. Lưu ý rằng trong thể thức sandwich phi cạnh tranh,
chất đánh dấu tỉ lệ thuận với kháng nguyên có trong mẫu. Trong khi đó, thể thức
cạnh tranh lại có số lượng kháng nguyên tỉ lệ nghịch với chất đánh dấu.
Hình 2.12. Xét nghiệm miễn dịch phóng xạ RIA sử dụng chất đánh dấu là đồng vị phóng xạ
Ngày nay phương pháp RIA vẫn được sử dụng, đặc biệt để phát hiện chất
phân tích có nồng độ rất thấp. Các bước cơ bản của RIA bao gồm:
(1) Đánh dấu phóng xạ cho mẫu chuẩn (kháng nguyên chuẩn). Thành phần phóng xạ thường được sử dụng là đồng vị gamma của iod được gắn với tyrosine.
(2) Thêm kháng thể với hàm lượng đã biết trước và đặc hiệu cho kháng nguyên
chuẩn đã được đánh dấu phòng xạ nói trên. Phản ứng kết hợp kháng nguyên - kháng thể sẽ xảy ra.
(3) Thêm mẫu huyết thanh cần xác định nồng độ kháng nguyên. Kháng nguyên
trong huyết thanh (chưa được đánh dấu phóng xạ và được gọi là “kháng nguyên
lạnh”) sẽ cạnh tranh với kháng nguyên đã được gắn chất phóng xạ để kết hợp với kháng thể.
(4) Kháng nguyên có nồng độ càng cao, lượng kháng nguyên kết hợp với kháng thể sẽ càng lớn và có khả năng cạnh tranh để kết hợp với kháng thể càng cao dẫn đến làm giảm tỷ lệ kháng nguyên chuẩn (đã được đánh dấu) kết hợp với kháng thể. Như vậy, một lượng kháng nguyên chuẩn được giải phóng.
(5) Kháng nguyên ở trạng thái kết hợp kháng nguyên – kháng thể sẽ được tách khỏi kháng nguyên tự do. Đây là bước quan trọng có tính quyết định mức độ chính xác của phép đo. Để thực hiện, một kháng kháng thể được thêm vào để tạo kết tủa với kháng nguyên chuẩn thứ nhất. Phần "cặn" sẽ được tách bằng phương pháp ly tâm. (6) Đo nồng độ của kháng nguyên chuẩn được giải phóng ở bước (4) thông qua tín hiệu phóng xạ đã được gắn với kháng nguyên chuẩn ở bước (1).
(7) Dựng đường biểu diễn nồng độ kết hợp kháng nguyên-kháng thể qua đó xác
định nồng độ kháng nguyên trong mẫu cần chẩn đoán.
RIA là phương pháp có độ nhạy cao nhưng nhược điểm của nó là yêu cầu thiết
bị hiện đại và chi phí lớn. Đặc biệt, RIA có sử dụng chất phóng xạ nên yêu cầu
nghiêm ngặt về an toàn trong quá trình xét nghiệm. Chính vì vậy RIA dần được
thay thế bằng ELISA, trong đó chất phóng xạ được thay bằng chất phát quang. 2.4.1.2. Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch men EIA
Trong kỹ thuật này, chất đánh dấu được sử dụng là enzym thay thế cho chất
phóng xạ. Các enzym thường được sử dụng là alkaline phosphatase ALP (Enzyme này hoạt động trong môi trường kiềm. ALP trong cơ thể được sản sinh ở bất kì tế
bào nào. Tuy nhiên, nó tiết ra nhiều nhất ở gan, thành ống mật, xương, rau thai),
horseradish peroxidase HRP, và B galactosidase. Nếu như RIA sử dụng chất phóng xạ để xác định mật độ chất phân tích thì EIA xác định theo sự thay đổi của màu sắc,
cường độ sáng hay tín hiệu khác. Thiết bị chuyên dụng đo lường những thay đổi đặc trưng để định lượng enzyme có trong mẫu.
2.4.2. Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch ELISA (Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay)
ELISA là xét nghiệm miễn dịch kiểu sandwich không đồng nhất được ứng
dụng để phát hiện kháng thể hay kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm. Phương pháp này kết hợp thuốc thử với chất đánh dấu emzyme-kháng thể với một kháng thể gắn kết pha rắn. Hiện nay ELISA được sử dụng rộng rãi trong nhiều lĩnh vực nghiên cứu như y học, nông nghiệp và đặc biệt là trong các quy trình kiểm tra an toàn chất lượng các sản phẩm sinh học . ELISA là một loại của phương pháp EIA.
Nguyên lý của ELISA chính là dựa vào tính đặc hiệu kháng nguyên - kháng thể và gồm các bước cơ bản như sau:
(1) Kháng nguyên chưa biết được gắn trên vi phiếm;
(2) Kháng thể biết trước được "rửa" qua bề mặt đó. Kháng thể này được gắn kết với enzyme;
(3) Thêm vào một cơ chất (substance); enzyme sẽ biến đổi cơ chất này và tạo tín hiệu có thể xác định được.
Đối với các ELISA phát quang, ánh sáng sẽ được phát ra từ mẫu chứa kháng nguyên- kháng thể. Sự hiện diện của phức hợp kháng nguyên-kháng thể sẽ quyết định cường độ sáng phát ra.
Với nguyên lý trên, ELISA giúp xác định sự có mặt hay không có mặt cũng như lượng kháng nguyên trong mẫu xét nghiệm.
Để tiến hành ELISA cần phải có ít nhất một kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên chưa biết. Thông thường kháng nguyên được cố định tại các giếng của vi phiếm.
- Phương thức cố định không đặc hiệu: kháng nguyên gắn trực tiếp vào bề mặt của đĩa;
- Phương thức gắn đặc hiệu ("sandwich" ELISA): kháng nguyên được gắn với một kháng thể đặc hiệu cho cùng kháng nguyên cần kiểm tra Kháng thể đặc hiệu được thêm vào, phản ứng tạo phức hợp kháng thể-kháng nguyên có thể xảy ra.
Nếu kháng thể được gắn trực tiếp với enzyme, tín hiệu quang học do enzyme làm biến đổi cơ chất sẽ giúp phát hiện kháng nguyên cần kiểm tra. Trong trường hợp sử dụng kháng thể thứ cấp (secondary antibody) được gắn với enzyme thông qua các liên kết cộng hóa trị giữa các phân tử sinh học (bioconjugation), kháng nguyên cần xác định sẽ được nhận biết qua kháng thể thứ cấp này.
Giữa các bước của ELISA, các protein và các kháng thể không đặc hiệu, kháng thể không gắn với kháng nguyên sẽ được lấy đi nhờ các loại dịch có tác dụng "rửa". Sau bước "rửa" cuối cùng, chỉ còn kháng thể liên kết với kháng nguyên được giữ lại. Sau khi được thêm vào, cơ chất sẽ chịu tác dụng của enzyme liên kết với kháng thể trong phức hợp kháng thể-kháng nguyên. Phản ứng phát quang (biến đổi cơ chất) sẽ xảy ra.
Trước đây các cơ chất tạo màu sắc được sử dụng trong ELISA nhưng ngày
nay các chất phát quang được dùng rộng rãi làm tăng tính đặc hiệu và độ chính xác của ELISA. Phương pháp ELISA thường được ứng dụng để xác định nồng độ của kháng thể trong huyết thanh; kiểm tra sự có mặt của kháng nguyên; phát hiện các yếu tố có khả năng gây dị ứng trong thực phẩm; xác định sự có mặt của dược phẩm; xác định hoạt tính của một hợp chất sinh học.
2.4.2.1. ELISA gián tiếp (indirect ELISA) Kỹ thuật này gồm các bước chính sau đây: Kỹ thuật này gồm các bước chính sau đây:
- Chuyển kháng nguyên đã biết lên bề mặt cứng ( được gọi chung là các đĩa). Kháng nguyên sẽ được cố định trên bề mặt. Nồng độ của các mẫu kháng nguyên này dùng để thiết lập đường chuẩn cho việc tính nồng độ của kháng nguyên trong các mẫu chưa biết.
- Chuyển các mẫu kháng nguyên chưa biết vào các giếng khác. Kháng nguyên chưa biết được hòa tan trong cùng một loại dung dịch đệm giống các mẫu kháng nguyên chuẩn.
Hình 2. 13. Kỹ thuật ELISA gián tiếp
- Thêm dung dịch protein không tương tác (non-interacting protein) như albumin huyết thanh bê hay casein vào tất cả các mẫu (kể cả mẫu chuẩn). Bước này được gọi là "blockin" do protein huyết thanh có tác dụng ngăn cản sự hấp phụ của các protein khác lên bề mặt của đĩa.
- Rửa bề mặt đĩa sau đó chuyển kháng thể (biết trước) vào tất cả các giếng của đĩa. Kháng thể sẽ kết hợp với các kháng nguyên đã được cố định mà không kết hợp với protein của huyết thanh.
- Thêm kháng thể thứ cấp (secondary antibody), kháng thể thứ cấp sẽ kết hợp với bất kỳ một kháng thể còn dư (bước này có thể được bỏ qua nếu kháng thể dùng để phát hiện kháng nguyên đã gắn với enzyme).
- Rửa đĩa, các kháng thể gắn enzyme còn dư sẽ được loại bỏ.
- Thêm cơ chất. Enzyme sẽ làm biến đổi cơ chất làm sản sinh tín hiệu huỳnh quang hay tín hiệu điện hóa học (enzyme có tác dụng như yếu tố khuyếch đại).
Nhược điểm cơ bản: Bước cố định kháng nguyên không có tính đặc hiệu nên bất kỳ protein nào cũng gắn với bề mặt đĩa vì vậy kháng nguyên (có nồng độ thấp) phải cạnh tranh với các protein khác trong huyết thanh khi gắn kết với bề mặt của đĩa. Sandwich ELISA hạn chế được nhược điểm này.
2.4.2.2. Sandwich ELISA
Phương pháp được sử dụng để phát hiện kháng nguyên trong mẫu nghiên
cứu và bao gồm các bước cơ bản sau (quy trình có thể được thay đổi trong nhiều
trường hợp):
(1) Chuẩn bị bề mặt có gắn kháng thể
(2) Khóa tất cả những vị trí gắn kết không đặc hiệu trên bề mặt. (3) Phủ mẫu chứa kháng kháng nguyên cần xác định
(4) Rửa đĩa, kháng kháng nguyên không được gắn kết sẽ bị rửa trôi (5) Thêm các kháng thể đặc hiệu cho kháng nguyên cần chẩn đoán
(6) Thêm kháng thể thứ cấp đã được gắn với enzym (kháng thể thứ cấp đặc hiệu cho kháng thể sơ cấp ở bước 5)
(7) Rửa đĩa, phần không gắn kết sẽ bị rửa trôi.
(9) Đo cường độ ánh sáng, tín hiệu huỳng quang, tín hiệu điện hóa... qua đó xác định sự có mặt và hàm lượng KT.
Hình 2.14. Các bước trong Sandwich ELISA. (1) Phủ đĩa bằng KT (2) Thêm mẫu cần xác định KN. KN (nếu có) sẽ gắn với KT; (3) kháng thể dùng để phát hiện được thêm vào và kết hợp với KN; (4) Thêm KT thứ cấp liên kết với enzyme. KT thứ cấp sẽ gắn với KT dùng để phát hiện; (5) Thêm cơ chất. Enzym sẽ làm biến đổi cơ chất và phát tín hiệu có thể phát hiện và đo được.
2.4.2.3. Kỹ thuật ELISA cạnh tranh
(1) "Ủ" kháng thể không được đánh dấu với kháng nguyên.
(2) Đưa hỗn hợp này vào các giếng của vi phiếm có chứa kháng nguyên.
(3) Rửa đĩa, kháng thể không được gắn kết sẽ bị rửa trôi. Lượng kháng nguyên càng lớn, lượng kháng thể gắn thành công với kháng nguyên trong đĩa càng thấp do "cạnh tranh".
(4) Thêm kháng thể thứ cấp (kháng thể của kháng thể ở bước 1). Kháng thể thứ cấp gắn với enzym.
(5) Thêm cơ chất. Lượng enzym còn dư sẽ giải phóng tín hiệu hỳnh quang hay tín hiệu màu.
càng yếu. Một số trường hợp, enzym được gắn với kháng nguyên chứ không phải kháng thể.
2.4.3. Xét nghiệm miễn dịch phân cực huỳnh quang FPIA
FPIA là một loại xét nghiệm miễn dịch cạnh tranh đồng nhất. Với tính chất gắn kết cạnh tranh, kháng nguyên của mẫu và thuốc thử đánh dấu AgF cạnh tranh nhau để có được vị trí gắn kết với kháng thể. Vì là xét nghiệm miễn dịch đồng nhất nên phản ứng được thực hiện trong một dung dịch duy nhất và phức hợp Ab – AgF không cần qua bước rửa để tách nó từ AgF tự do.
Hình 2.15. Xét nghiệm miễn dịch phân cực huỳnh quang cạnh tranh
FPIA được sử dụng để xác định chính xác và nhạy với chất phân tích là các
độc chất nồng độ thấp như thuốc điều trị, thuốc bị lạm dụng, chất độc và một số hoocmon. Thuốc thử FPIA gồm các thành phần sau:
S – thuốc thử kháng thể: huyết thanh miễn dịch để phân tích T - chất đánh dấu: chất phân tích đánh dấu phát sáng
P - chất rửa tiền xử lý: tạo điều kiện thuận lợi tách thuốc ra khỏi
protein huyết thanh.
FPIA sử dụng ba yếu tố căn bản để đo lường chất phân tích theo thể thức đồng nhất: huỳnh quang, quay các phân tử trong dung dịch và ánh sáng phân cực.
‐ Huỳnh quang: là chất đánh dấu phát sáng hấp thụ năng lượng ánh sáng ở bước
sóng 490nm và giải phóng năng lượng này ở bước sóng lớn hơn (520nm) dưới dạng ánh sáng huỳnh quang.
Hình 2.16. Phát hiện huỳnh quang trong liên hợp phức huỳnh quang
‐ Quay các phân tử trong dung dịch: Trong một dung dịch, các phân tử lớn quay
chậm hơn các phân tử nhỏ. Nguyên lý này được sử dụng để phân biệt phân tử kháng nguyên đánh dấu AgF nhỏ hơn quay nhanh hơn với phức hợp Ab – AgF lớn hơn quay chậm trong dung dịch.
‐ Ánh sáng phân cực: Kỹ thuật phân cực huỳnh quang phân biệt AgF với liên hợp
phức Ab-AgF thông qua đặc điểm phân cực ánh sáng khác nhau của chúng khi được chiếu sáng phân cực. Ánh sáng phân cực chỉ xuất hiện trên một không gian phẳng. Khi ánh sáng phân cực bị hấp thụ bởi phân tử AgF nhỏ hơn thì phân tử này có khả năng xoay vị trí của nó trong dung dịch nhanh chóng trước khi ánh sáng huỳnh quang được phát ra. Ánh sáng giải phóng ra phát tới một mặt phẳng không gian khác nên được gọi là ánh sáng phân cực. Phức hợp Ab- AgF kích thước lớn hơn không xoay nhanh trong dung dịch nên ánh sáng được giải phóng ra vẫn nằm trên mặt phẳng không gian ban đầu. Một cảm biến sẽ thu nhận để đo lường ánh sáng này.
Hình 2.17. Đo lường phức hợp kích thước lớn bằng ánh sáng, quay và ánh sáng phân cực trong kỹ thuật FPIA
Hình 2.18. Phức hợp kích thước nhỏ hơn sẽ cho cường độ sáng thấp hơn
2.4.4. Kỹ thuật xét nghiệm miễn dịch enzyme vi hạt MEIA (Microparticle Enzyme Immunoassay) Enzyme Immunoassay)
MEIA là một phương pháp xét nghiệm miễn dịch thực hiện bằng cách cô lập phức hợp kháng nguyên/kháng thể trên bề mặt rắn của các hạt rất nhỏ gọi là vi hạt. MEIA được sử dụng rộng rãi trong đo lường tựđộng các phân tử có kích thước lớn là dấu hiệu liên quan tới các bệnh tim mạch, khả năng thụ tinh, ung thư, sự trao đổi chất, viêm gan và xét nghiệm tuyến giáp. MEIA gồm các thành phần sau
Hình 2.19. Các thành phần của MEIA
Microparticle-Antibody Solid Phase: Vi hạt được bao phủ bằng các kháng thểđặc hiệu với chất phân tích được đo;
Antibody-Enzyme Conjugate: enzyme ALP được gắn vào kháng thể; Cơ chất enzyme: Fluorescent 4-Methyl Umbelliferone Phosphate (MUP) trong dung dịch để có thể phản ứng với enzyme gắn trên
kháng thể.
Ma trận làm bằng sợi thủy tinh có tác dụng bắt các bộ phức kháng nguyên/kháng thể. Phương pháp MEIA sử dụng thể thức phi cạnh tranh nên lượng chất phân tích tỉ lệ thuận với tín hiệu.
Tóm tắt cách thức các thành phần làm việc trong liên kết với mẫu xét nghiệm để tạo ra tín hiệu và cho kết quả xét nghiệm tương ứng được mô tả như trong hình.
Hình 2.20. Quá trình thực hiện của phương pháp MEIA
2.4.5. Xét nghiệm miễn dịch ECL (electrochemiluminescence)
ECL là một quá trình xảy ra với nhiều phân tử như ruthenium, osmium, rhenium và các thành phần khác. Trong quá trình này, các phản ứng hóa học xảy ra
M t s ph c h p trong h n h p đ c truy n t i l i s i th y tinh Các kháng th kháng‐kháng ch t phân tích đã đánh d u ALP k t h p v i ph c h p vi h t. C ch t MUP đ c đ a vào l i. S n ph m phát huỳnh quang là MU đ c đo l ng.
trên bề mặt của một điện cực tạo ra một số chất từ tiền chất ổn định. Các chất mới tạo ra này phản ứng với nhau để phát ánh sáng. Sự phát triển của kỹ thuật ECL dựa
trên cơ sở sử dụng phức chất ruthenium(II)-tris(bipyridyl) [Ru(bpy)3] 2+ và
tripropylamine (TPA). Sản phẩm của phản ứng quang hóa cuối cùng được thu nhận bằng cảm biến ánh sáng.
Phức chất ruthenium khi bị kích thích điện tạo điều kiện cho các phản ứng
quang hóa và tạo ra ánh sáng. Quá trình bắt đầu khi một điện áp được đặt vào điện cực tạo ra điện trường tác động lên các phức hợp miễn dịch (bao gồm cả phức hợp
ruthenium) đã được gắn vào các vi hạt phủ streptavidin. Ưu điểm của việc kích
thích phản ứng quang hóa bằng điện là có thể điều khiển chính xác toàn bộ quá
trình.
Phản ứng ECL trên bề mặt điện cực
Hình 2.21. Phát hiện phức hợp miễn dich đánh dấu ruthenium
Hai hoạt chất là phức hợp ruthenium và TPA bị kích thích điện để phản ứng tạo ra ánh sáng. Cả hai chất này đều giữ nguyên trạng thái ổn định khi chưa có điện áp tác động.