a. Chuẩn hóa phương pháp đo độ tinh khiết hóa phóng xạ của18F-NaF trên HPLC 1200 của hãng Agilent
• Điều kiện sắc ký
+ Cột Carbopac PA 10 (Dionex) dài 250 mm, đường kính 4,5 mm, đường kính bên trong cột là 1mm.
+ Bộ tiêm mẫu bằng tay đa van thể tích vòng 20µl. + Tốc độ dòng 1ml/phút.
+ Thời gian chạy mẫu 10 phút. + Nhiệt độ 250C.
+ Chiều dài bước sóng đầu đo UV là 220 nm.
+ Cột được chạy với dung môi pha động là dung dịch natri hiđroxit 0,1M, tốc độ 1ml/phút trong 30 phút trước khi tiêm mẫu.
+ Dung dịch chuẩn mẹ được pha từ 100 mg NaF trong 20 ml nước siêu tinh khiết. Từ dung dịch mẹ sẽpha ra các dung dịch theo yêu cầu. + Mẫu18F-NaF được pha loãng theo tỷ lệ 1:5 với dung dịch NaCl 0,9%. • Chuẩn hóa HPLC
18F-NaF được xác định bởi giá trị thời gian lưu (tR) trên phổ phóng xạ, so sánh với tR của NaF tham chiếu được xác định trên phổ UV. Thời gian lưu của NaF và18F-NaF không trùng nhau vì mẫu đi qua đầu đo phóng xạ trước khi đến đầu đo UV. Do vậy, cần xác định tỷ lệ sai khác tR, sau đó hiệu chỉnh lại tR của 18F-NaF. Chúng tôi kiểm tra 5 lần/1mẫu18F-NaF và xác định độ chênh lệch giữa 2 thời gian lưu (phút) và độ sai lệch (%) giá trị hiệu chỉnh của18F-NaF so với đường chuẩn NaF.
• Các chỉ tiêu chuẩn hóa theo ICH Q2(R1):
Bảng 2.4. Các chỉ tiêu yêu cầu chuẩn hóa theo ICH Q2(R1)
TT Các chỉ tiêu Yêu cầu
1 Sai lệch thời gian lưu của NaF và
18F-NaF
5%
2 Độ tuyến tính R2 ≥0,990
3 Độ chính xác RSD≤5%
b. Xác định độ pha loãng mẫu 18F-NaF phù hợp với mẫu thử nhanh nội độc tố vi khuẩn
• Tính toán mức pha loãng chuẩn tối đa (MVD)
Mức pha loãng chuẩn tối đa MVD được tính theo công thức sau [31], [79]: MVD = (Giới hạn nội độc tố×nồng độ mẫu )1
λ
Trong đó: giới hạn nội độc tố vi khuẩn là 175VEU/ml với Vlà thể tích tối đa 1 lần tiêm (quy ước là 15 ml). Nồng độ dung dịch mẫu là 1ml/ml và λ là độ nhạy của phương pháp hay là giá trị thấp nhất trên đường chuẩn nội độc tố vi khuẩn (0,05VEU/ml). Từ đó cho thấy MVD≈230, nghĩa là mẫu
18F-NaF có thể pha loãng tối đa là 1:230, để ngăn chặn nguy cơ ức chế hay thúc đẩy các yếu tố ảnh hưởng.
• Chuẩn bị mẫu18F-NaF:
Lấy mẫu 18F-NaF từ 3 mẻ sản xuất tại Bệnh viện TƯQĐ108, với nồng độ phóng xạ khoảng 90 mCi/ml, sau đó tiến hành pha loãng ở các nồng độ 1:1; 1:10 và 1:100 với nước trong kit LAL. Kiểm tra pH của mẫu, phải trong khoảng 6,0 – 8,0 [48].
• Tiến hành:
Sử dụng micropipet lấy 25µL mẫu vào mỗi giếng trên thẻ. Máy sẽtự động trộn mẫu với chất phản ứng trong thẻ. Sau khi trộn, máy đo mật độ quang của các giếng và phần mềm sẽxử lý số liệu dựa trên đường chuẩn đã được lưu trữ trong máy. Sử dụng phương pháp đo kép (2 mẫu và 2 mẫu đối chứng dương) đáp ứng yêu cầu của USP và FDA đối với kiểm tra nội độc tố vi khuẩn theo phương pháp LAL.
• Thông số yêu cầu phải đạt:
Các thông số yêu cầu khi thực hiện kỹ thuật LAL trên máy PTS [36], [56] được thể hiện trong bảng 2.5.
Bảng 2.5. Bảng thông số kiểm tra nội độc tố trên PTS
TT Các thông số Yêu cầu
1 Giới hạn nội độc tố vi khuẩn trong mẫu (EU/ml)
≤11,6
2 Độ sai lệch hệ số mẫu (CV1) (%) ≤25
3 Độ sai lệch hệ số thêm vào (spike) (CV2) (%) ≤25 4 Kiểm soát mẫu dương (PPC) (EU/ml) 0,305a và
1,22b
5 %tìm lại thêm vào (spike) 50 - 200
Ở đây:atheo USP 2020 và chỉ số chấp nhận đối với một chuyên luận có giá trị theo Charles River.b là thông số ghi trên lô thẻ PTS.
Vì thể tích tối đa 1 lần tiêm 18F-NaF là 15 ml nên giới hạn nội độc tố vi khuẩn của sản phẩm này là 11,6 EU/ml. Độ sai lệch của các hệ số CV cho thấy giá trị phân tích thống kê khác bao nhiêu so với đối chứng. Nếu các giá trị này ≥ 25% mẫu thử thì không có giá trị và cần phải làm lại. Việc kiểm soát mẫu dương cho phép xác định các yếu tố ảnh hưởng trong mẫu, có thể gây ra ức chế hoặc tăng cường phản ứng LAL. Theo USP, một mẫu gel-clot có thể dương tính khi được thêm vào với một mẫu nội độc tố vi khuẩn chuẩn (2λ) và tỷ lệ tìm lại thêm vào phải trong khoảng 50-200%đối với các phương pháp động học. Vì vậy, tỷ lệ pha loãng mẫu hầu hết tuân thủ theo các thông số này.
c. Đánh giá chất lượng dược chất phóng xạ18F-NaF
Sau khi điều chế, 18F-NaF sẽđược kiểm tra chất lượng. Mẫu sản phẩm được đánh giá theo các tiêu chuẩn của USP 2020 bao gồm các chỉ tiêu sau:
• Tính chất: trong suốt, không màu, không hạt (Quan sát bằng mắt thường qua kính chì)
• pH: 4,5 – 8,0 (Phương pháp so màu trên giấy quỳ)
• Độ tinh khiết HPX:≥95%(Phương pháp sắc ký lỏng cao áp – HPLC) • Chu kỳ bán rã: 105 – 115 phút (Phương pháp giếng đo hoạt độ phóng xạ) • Độ tinh khiết hạt nhân: phân rã của18F≥ 99,5%trên phổ gamma và xuất
hiện đỉnh năng lượng 511 keV hoặc có thêm đỉnh năng lượng 1022 keV tùy vào loại đầu dò phóng xạ (Phương pháp phân tích phổ gamma đa kênh). • Nội độc tố vi khuẩn:≤175VEU/ml (Phương pháp đo màu động học). • Độ vô khuẩn: Vô khuẩn (Phương pháp nuôi cấy).
d. Đánh giá độ ổn định của dược chất phóng xạ 18F-NaF
Độ ổn định của 18F-NaF được đánh giá trong 8 giờ, dựa trên một số chỉ tiêu chính theo USP 2020 như: Tính chất, pH, Độ tinh khiết HPX, chu kỳ bán rã và nội độc tố vi khuẩn.
Mẫu của mỗi lô được chia ra làm 2 lọ riêng. Một lọ được để theo phương thẳng đứng và lọ kia được để dốc, ngược xuống. Nhiệt độ duy trì trong khoảng 20-25oC. Lọ đầu tiên được sử dụng để kiểm tra sự biến đổi trong vòng 8 giờ kể từ khi kết thức điều chế. Lọ dốc ngược để kiểm tra sự thay đổi về Tính chất, độ tinh khiết HPX và pH sau 8 giờ kể từ khi chia liều DCPX.
Để xác định độ ổn định của18F-NaF, chúng tôi đánh giá chất lượng tại các thời điểm khác nhau dưới tác động của môi trường, riêng độ ẩm không khảo sát vì đây là thuốc tiêm được đóng gói kín trong lọ thủy tinh. Tuy nhiên, trong quá trình lấy DCPX tiêm cho bệnh nhân, nhân viên y tế phải dốc ngược lọ, do đó DCPX sẽtiếp xúc trực tiếp với nút cao su nên chúng tôi khảo sát sự ảnh hưởng của nút cao su đến độ ổn định của18F-NaF.