Khả năng kháng oxy hóa bằng phương pháp DPPH
Nguyên tắc:
Các chất nghiên cứu có tác dụng kháng oxy hóa theo cơ chế bắt gốc tự do sẽ chuyển gốc tự do DPPH (1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) từ màu tím sang màu vàng nhạt. Các chất có khả năng kháng oxy hóa sẽ trung hòa gốc DPPH bằng cách cho hydrogen, làm giảm độ hấp thu tại bước sóng cực đại và màu của dung dịch phản ứng sẽ nhạt dần.
Xác định khả năng bắt gốc tự do của chất nghiên cứu bằng phương pháp đo độ hấp thu của mẫu tại bước sóng λ = 517 nm. Vitamin C được biết đến với khả năng kháng oxy hóa vượt trội, được sử dụng làm chất đối chiếu. [6]
Sàng lọc khoảng nồng độ ức chế
Phương pháp tiến hành:
Quy trình được thực hiện theo phương pháp của Brand – Williams (1995) và có một số thay đổi phù hợp.
Thực hiện với mẫu ở nồng độ thử nghiệm:
Mẫu được hòa tan trong methanol thành các nồng độ thử nghiệm 100 ppm, 10 ppm, 1ppm.
DPPH được hòa tan trong dung môi methanol thành nồng độ 6 mM (dung dịch này không bền ánh sáng nên chỉ pha ngay trước khi sử dụng).
21 Hỗn hợp phản ứng chứa:
2400 μL methanol.
500 μL dung dịch mẫu ở nồng độ thử nghiệm
100μL dung dịch DPPH trong methanol
Hỗn hợp được lắc đều, để yên cho phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi tiến hành đo độ hấp thu.
Thực hiện với mẫu đối chiếu và mẫu trắng
Vitamin C được hòa tan trong methanol thành nồng độ 0,6 μg/mL.
Hỗn hợp phản ứng có thành phần tương tự như mẫu thử nghiệm, chỉ thay dung dịch mẫu bằng dung dịch vitamin C (đối với mẫu đối chiếu) hoặc methanol (đối với mẫu trắng). Hỗn hợp được lắc đều, để yên cho phản ứng ở nhiệt độ phòng trong 30 phút rồi tiến hành đo độ hấp thu.
Hình 2.4: Quy trình đánh giá khả năng kháng oxy hóa DPPH 100μL dung dịch DPPH
500 μL dung dịch
Lắc đều
Ủ trong tối 30 phút, 30 oC
22
Xác định giá trị IC50
Từ kết quả khảo sát mẫu ở các nồng độ thử nghiệm, tiến hành thí nghiệm tương tự với 7 nồng độ phù hợp là 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15.625 ppm.
Giá trị IC50 được tính bằng phần mềm GraphPad Prism thông qua đường chuẩn phần trăm ức chế (đường chuẩn được xây dựng bằng 7 nồng độ khác nhau).
Phần trăm bắt gốc tự do DPPH được tính theo công thức sau:
%Q = [1 − A − Ac
A0− Ac] x 100 Trong đó:
A : độ hấp thu dung dịch chứa mẫu thử A0 : độ hấp thu dung dịch chứa mẫu trắng Ac : độ hấp thu dung dịch chứa chất đối chiếu