Hiện nay có nhiều nghiên cứu trong và ngoài nƣớc cho thấy việc vi bao các vi khuẩn lactic đem lại kết quả nhƣ mong đợi. Điển hình qua bài báo cáo của tác giả Nguyễn Thúy Hƣơng và cộng sự (2008).[10]. Nhóm tác giả báo cáo rằng, vi khuẩn lactic dễ bị hao hụt trong môi trƣờng sữa chua có độ axit cao, do đó đã tiến hành thực hiện vi gói hai chủng vi khuẩn L. bulgaricus và Streptococcus thermophillus bằng phƣơng pháp nhốt trong nguyên liệu natri alginate. Kết quả nghiên cứu cho thấy hạt vi gói có kích thƣớc 1,2 mm vừa có thể bảo vệ vi khuẩn, vừa không làm thay đổi chất lƣợng cảm quan sản phẩm sữa chua đậu nành [10]. Thông qua nguyên liệu hỗn hợp alginate – xanthan, nhóm nghiên cứu Liêu Mỹ Đông và cộng sự (2011), đã vi bao vi khuẩn Bifidobacteria Bifidum với mục đích nâng cao hoạt tính probiotic của vi khuẩn này. Kết quả nghiên cứu cho thấy, khi nồng độ Ca-alginate đƣợc giữ cố định là 2.5% thì hiệu quả bảo vệ tăng theo chiều tăng nồng độ Xanthan gum từ 0.1 đến 0.2% và đạt hiệu quả cao nhất ở 0.2%. [10].
Theo Nguyễn Thị Tuyết và công sự (2014) đã tiến hành bao gói nấm men
S.boulardii với nguyên liệu bao là natri alginate bổ sung gelatin. Nhóm tác giả tiến hành bao gói S.boulardii bổ sung gelatin với nồng độ 0.25, 0.5, 0.75 và 1.0 (%w/v) trong đó với nồng độ geletine 0.75 (%w/v) cho hiệu suất bao gói cao nhất. [30]
17
Theo Trần Huỳnh Nhƣ và công sự (2014) cũng tiến hành bao gói nấm men
S.boulardii cũng với nguyên liệu bao gói là natri alginate có bổ sung matodextrin. Nhóm cũng tiến hành bao gói S.boulardii có bổ sung matodextrin ở các nồng độ 1, 1.5, 2 và 2.5 (%w/v) trong đó hiệu suất bao gói của matodextrin 1 (%w/v) cho hiệu suất cao nhất. [43]. Kết quả cho thấy khi bổ sung các vật liệu bao với tỉ lệ thích hợp thì hiệu suất bảo vệ nấm men S.boulardii sẽ đƣợc tăng lên.
18
Hình 1.8. Bề mặt vi bao của mẫu khô (A) và hạt vi bao khô nghiền (B)
B A
19
Qua các nghiên cứu ngoài nƣớc tiêu biểu nhƣ: nghiên cứu của Lee và cộng sự (2000) cho rằng tỷ lệ sống sót của Bifidobacteria longum KCTC 3128 và HLC 3742 trong dịch dạ dày và muối mật đƣợc cải thiện một cách đáng kể khi cố định chúng trong các hạt calcium alginate có chứa 2, 3, 4% natri alginate. Họ kết luận rằng, tỷ lệ chết của
Bifidobacteria longum giảm tỷ lệ với việc tăng cả nồng độ gel alginate và kích thƣớc hạt. Ngoài ra nghiên cứu về hỗn hợp chitosan–alginate-carboxymethyl chitosan vi bao
Lactobacillus casei ATCC 393 của nhóm tác giả Li và cộng sự (2011). Tác dụng của vi bao rõ rệt khi ủ các hạt vi bao trong dịch dạ dày có pH = 2 trong 1 giờ và muối mật 1% trong vòng 6 giờ, Lactobacillus casei vẫn sống sót với mật độ là 7.91 và 7.42 log cfu/g.
Theo Xiao Yan Li và cộng sự (2009), kết hợp vật liệu gelatin-alginate có hiệu quả cao khi vi bao Lactobacillus casei ATCC 393 bằng phƣơng pháp nhỏ giọt. Trƣờng hợp này số tế bào sống sót lên đến 107 cfu.g-1 (hạt vi bao đƣợc thổi khô) và kích thƣớc hạt đạt 1,1 ± 0,2 mm. Lactococci đƣợc vi bao trong màng gelatin tạo liên kết ngang với toluene-2,4- disocyanate trong hệ tiếp xúc dầu/nƣớc. Để tránh độc tố chất thử, nhóm nghiên cứu đã sử dụng chất phân tán là dầu thực vật và dầu silicone đồng thời hạn chế sự tiếp xúc tế bào với nƣớc để bảo vệ các liên kết ngang không tan trong nƣớc. Tốc độ tăng trƣởng của tế bào tăng sau khi giải phóng khỏi viên nang đƣợc theo dõi trong suốt quá trình lên men và acid hóa. Kết quả quá trình acid hóa sữa ở pH = 5.5 trong 2.8 giờ là mật độ tế bào đƣợc vi bao đạt 109
20
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP 2.1. Địa điểm thực hiện đồ án
Địa điểm: Phòng thí nghiệm Hóa sinh và Vi sinh Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Khoa Công nghệ Hóa học và Thực phẩm, Trƣờng Đại Học Sƣ Phạm Kỹ Thuật TP HCM.
2.2. Vật liệu sử dụng cho nghiên cứu2.2.1. Vật liệu 2.2.1. Vật liệu
Natri alginate (Xilong chemical, China), gelatin (Zungbunzlauer, France, độ ẩm 11.90 ± 0.09 %, hàm lƣợng protein 87.31 ± 0.05 %), canxi clorua (Guangdong Guanghua, China), glucose (Xilong chemical, China) và pepton (Xilong chemical, China), HCl (Xilong chemical, China). Dung dịch đệm có pH = 7.0 M (gồm gồm 8 g NaCl (Xilong chemical, China), 0.2 g KCl (Xilong chemical, China), 1.44 g Na2HPO4 (Xilong chemical, China), 0.24 g KH2PO4 (Xilong chemical, China)).
2.2.2. Chủng vi sinh vật sử dụng và môi trƣờng
Đối tƣợng nghiên cứu là Saccharomyces boulardii phân lập từ chế phẩm đông khô
BiofloraTM của Biocodex, Pháp. Môi trƣờng Hansen (trong 100 ml môi trƣờng chứa glucose 10 g, pepton 1g, KH2PO4 0.3 g, MgSO4.7H2O 0.2 g, cloramphenicol 40 ppm). Môi trƣờng giả lập dịch dạ dày (0.08M HCl, 0.2% NaCl, pH 1.5). Môi trƣờng giả lập dịch ruột (0.05 M KH2PO4 , pH 7.25, 0.6% muối mật)
2.3. Phƣơng pháp phân tích thu nhận kết quả 2.3.1. Phân tích vi sinh 2.3.1. Phân tích vi sinh
Xác định số lƣợng tế bào nấm men bằng cách đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri bằng kỹ thuật trải đĩa có môi trƣờng Hansen [44].
2.3.2. Phân tích hóa sinh
Xác định pH dung dịch đệm bằng máy đo pH Eutech instruments pH 510. Xác định độ ẩm bằng tủ sấy đối lƣu (theo AOAC 1984), sấy ở 1050C đến khối lƣợng không đổi. Hàm lƣợng protein gelatin đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Micro-Kjeldahl [42]
Độ ẩm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sấy đối lƣu đến khối lƣợng không đổi 1050 C, sử dụng thiết bị sấy đối lƣu. Công thức xác định độ ẩm:
21 % Độ ẩm = 100 w w w f i i
Trong đó: wf, wi lần lƣợt là khối lƣợng của nguyên liệu trƣớc và sau quá trình sấy (AOAC, 1984).
2.3.3. Phƣơng pháp thống kê và xử lí số liệu
Dựa trên kết quả 3 lần thí nghiệm lặp lại. Xử lý kết quả bằng phần mềm Excel versions 2010 và IBM SPSS Statistics 20.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Quá trình chuẩn bị
Hoạt hóa S.boulardii ở 300C trong 24 giờ trong 10 ml môi trƣờng Hansen, tiếp đến chuyển toàn bộ sang bình có chứa 100 ml môi trƣờng Hansen nuôi cấy cùng điều kiện.. Quá trình nhân giống thực hiện trong điều kiện hiếu khí, sử dụng thiết bị khuấy từ với tốc độ 300 vòng/phút. Huyền phù sau lên men đƣợc ly tâm thành nhiều bình, mỗi bình chứa 100 ml huyền phù. Quy trình ly tâm cụ thể nhƣ sau: 100ml huyền phù đƣợc ly tâm một lần với tốc độ 4000 rpm trong 15 phút [39], sau đó bổ sung 100ml nƣớc muối sinh lý (0.9% NaCl ở 400C) đƣợc cho vào, trộn đều với cặn ly tâm và cũng ly tâm với tốc độ tƣơng tự. Quy trình rửa tế bào S. boulardii nói trên đƣợc rửa hai lần, một lần với nƣớc muối sinh lý và lần thứ hai với nƣớc cất (100ml), cuối cùng thu sinh khối và chuẩn bị cho vi bao.
Quá trình vi bao: chuẩn bị 2g alginate pha vào 25 ml nƣớc vô trùng ở khoảng 450C và hòa tan hoàn toàn bằng máy khấy từ ở 120 rpm sau đó đem tiệt trùng ở 121 trong 15 phút rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng. Pha sinh khối S.boulardii (thu đƣợc từ 25 ml dung dịch sinh khối) vào 25 ml nƣớc cất vô trùng. Trộn dung dịch alginate vào dung dịch huyền phù. Đồng thời bổ sung thêm 0.75% w/v gelatin. Đồng nhất dung dịch trên ở 50
C, dùng kim tiêm tạo giọt bơm trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,75% sau đó để ổn định 60 phút ở 50C [9]. Lọc, rửa 1 lần nƣớc muối sinh lý vô trùng (0.9%) và 1 lần nƣớc cất vô trùng, để ráo => thu đƣợc hạt vi bao tƣơi (mẫu không sấy).
Quá trình sấy: hạt vi bao đƣợc sấy đối lƣu (450C trong 5 giờ) => hạt sấy
Một phần hạt sấy đƣợc đem đi nghiền mịn lọc qua ray có kích thƣớc lỗ No.56 (kích thƣớc mắt lƣới 308 m).
22
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng.
2.4.2. Khảo sát đặc tính sinh học
Mục đích thí nghiệm: kiểm tra tính thuần và hình dạng tế bào S.boulardii.
Tiến hành thí nghiệm: Giống S.boulardii (100mg) trong gói Bioflo của hãng Biocodex, Pháp đƣợc hoạt hóa 24 giờ ở 300C trong môi trƣờng Hansen. Cấy truyền
S.boulardii trên môi trƣờng thạch nghiêng, ủ 24 giờ ở 300C. Cấy giống thuần từ ống thạch nghiêng sang đĩa petri môi trƣờng Hansen (ủ 24 giờ, 300
C). Sau thời gian ủ, quan sát hình thái tế bào, chọn khuẩn lạc đặc trƣng quan sát trên kính hiển vi [28].Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng.
2.4.3. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của S.Boulardii
Mục đích thí nghiệm: chọn thời điểm thích hợp thu sinh khối cao nhất để kết thúc giai đoạn nhân giống.
Tiến hành thí nghiệm: Bằng cách chuyển giống cấp 1 từ ống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng Hansen lỏng, ủ 48 giờ ở 300
C. Chuyển giống cấp 2 từ ống nghiệm sang bình cầu 250 ml (thể tích giống 10%), trong điều kiện 300
C có khuấy lắc. Sau mỗi giờ lấy mẫu trải đĩa kiểm tra mật độ tế bào 1 lần. Đĩa đƣợc ủ ở 300C sau 48 giờ đếm số khuẩn lạc trên đĩa và tính mật độ tế bào theo công thức sau:
Mật độ tế bào =
x R
Trong đó: N là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa (chỉ lấy các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và nồng độ pha loãng là liên tiếp nhau). n là số đĩa ở nồng độ pha loãng f. V là thể tích mẫu đƣa vào đĩa (ml), R là độ chính xác. [14]
Dựa vào mật độ tế bào tính đƣợc dựng đƣờng cong sinh trƣởng của S.boulardii.
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng.
2.4.4. Vi bao S.Boulardii với Natri Alginate có bổ sung gelatin
Mục đích thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của gelatin (G) trong sự vi bao S. boulardii bằng Natri alginate.
23
Áp dụng phƣơng pháp nhỏ giọt dựa trên phƣơng pháp của Krasaekoopt và cộng sự [33] bổ sung alginate (2%) và CaCl2 (0,75%) [48].
Nhằm mục đích khảo sát khả năng sống sót của S.boulardii trong hạt vi bao có bổ sung gelatin vào dung dịch alginate. Mẫu có bổ sung gelatin 0.75% w/v đƣợc cho vào dung dịch alginate đã tiệt trùng. Bổ sung sinh khối S.boulardii (108 cfu/ml) vào dung dịch hỗn hợp alginate theo tỷ lệ dung dịch huyền phù/Natri alginate = 1/2. Đồng nhất dung dịch trên trong điều kiện lạnh 50
C, dùng kim tiêm tạo giọt trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,75% sau đó để ổn định 30 phút trong tủ lạnh 50
C. Lọc, rửa 1 lần nƣớc muối sinh lý (0.9%) và 1 lần nƣớc cất, để ráo và trữ ở điều kiện lạnh 350
C (mẫu không sấy) hoặc sấy đối lƣu (450C, 5 giờ) sau đó lƣu trữ ở điều kiện 350C (mẫu sấy) từ 0-12 ngày.
Xác định mật độ tế bào sống sót đƣợc phóng thích ra khỏi vi bao bằng cách cho hạt vi bao vào dung dịch đệm photphate (pH = 7.0 M)[25]. Bổ sung 1 g hạt vi bao vào 9 ml dung dịch đệm photphate trong 60 phút [25]. Sử dụng mẫu đối chứng là mẫu không bổ sung gelatin. Tiến hành trải đĩa kiểm tra mật độ tế bào sau 0, 3, 6, 9 và 12 ngày (đối với cả 2 mẫu). Đĩa petri chứa huyền phù nấm men đƣợc ủ ở 300C trong 48 giờ.
Xác định mật độ tế bào sống sót sau khi thử dịch giả lập dạ dày bằng cách cho 1g hạt tƣơi vào 10ml dung dịch giả lập dạ dày (0.08M HCl thêm 0.2% NaCl, pH=1.5) không có pepsin ở 370C lần lƣợt trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút [34]. Còn đối với hạt khô và hạt khô nghiền cân 0,063g cho vào 10ml dung dịch giả lập dạ dày lần lƣợt trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút. Sau đó tiến hành trãi đĩa kiểm tra mật độ tế bào.
Tƣơng tự tiến hành khảo sát khả năng tế bào sống sót trong dịch muối mật bằng cách cho các mẫu hạt ngâm trong giả lập dạ dày trong 60 phút sau đó cho vào giả lập dịch ruột (0.05 M KH2PO4, pH =7.25 có thêm 0.6% muối mật) trong 30, 60, 90 và 120 phút. [34].
Đánh giá mật độ tinh thể đƣợc đo bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (Miniflex gonio Meter, Nhật Bản) bức xạ Cu (30kv × 15mA). Thiết bị đƣợc vận hành ở chế độ liên tục trong khoảng thời gian 1°/phút và quét qua một loạt 2θ từ 10 đến 90°. Cân 2g alginate cho vào 25ml nƣớc cất khuấy đều sau đó đem tiệt trùng 121 trong 15 phút. Mẫu A: thêm 25ml nƣớc cất vô trùng vào bình chứa 2g alginate đã tiệt trùng. Mẫu B: tƣơng tự mẫu A nhƣng bổ sung thêm gelatin tỉ lệ 0.75%w/v, mẫu C: tƣơng tự mẫu B có bổ sung thêm sinh
24
khối S.boulardii (thu đƣợc từ 25ml dung dịch sinh khối). 3 mẫu A, B, C đƣợc đồng nhất ở 50C, dùng kim tiêm tạo giọt bơm trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,75% sau đó để ổn định 60 phút ở 50C [9]. Lọc, rửa 1 lần nƣớc muối sinh lý vô trùng (0.9%) và 1 lần nƣớc cất vô trùng, để ráo. Đem mẫu đi sấy khô ở 45 trong 5 giờ.
Phƣơng pháp tính CFU/g hạt tƣơi:
CFU/g =
Trong đó: N là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa (chỉ lấy các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và nồng độ pha loãng là liên tiếp nhau). n là số đĩa ở nồng độ pha loãng f. V là thể tích mẫu đƣa vào đĩa (ml). [14]
Sau đó sẽ đƣợc tính theo log.
1g hạt tƣơi sau khi sấy khô sẽ còn lại 0.063g hạt sấy (tƣơng đƣơng 0.063g hạt sấy nghiền). theo thí nghiệm chúng tôi tiến hành bao gói 50g dung dịch sau khi nhỏ giot còn 38g mẫu T, theo tỉ lệ tam xích thì 1g hạt tƣơi sẽ bằng 1.3ml dung dịch. Vậy mẫu ĐC =1.3ml.
Vậy: 1.3ml ĐC (tƣơng đƣơng 8 CFU) = 1g T = 0.063g S = 0.063g SN
Định hƣớng nghiên cứu: Theo những nghiên cứu về bao gói alginate bằng phƣơng
pháp nhỏ giọt trƣớc đây chúng tôi nhận thấy rằng việc việc bổ sung thêm chất bao từ protein giúp bảo vệ tế bào nấm men tốt hơn. Trong bài nghiên cứu này chúng tôi chú trọng làm rõ khả năng sống sót của việc bao gói nấm men S.boulardii bằng gel alginate có bổ sung chất bao là gelatin trong môi trƣờng giả lập dạ dày và dịch ruột. Việc lƣu trữu những mẫu bao gói theo thời gian cũng đƣợc chú trọng, chúng tôi tập trung lƣu trữ ở 2 điều kiện nhiệt độ 5 và 30 để so sánh xem nhiệt độ lƣu trữ nào tốt hơn. Đồng thời chúng tôi cũng nghiền mịn các mẫu hạt bao gói khô để xem xét khả năng sống sót và bảo quản của hạt bao gói. Đây là điểm mới của bài chúng tôi.
25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kiểm tra đặc tính sinh học của S.boulardii
3.1.1. Quan sát hình thái S.boulardii
Khuẩn lạc S.boulardii (A) có hình tròn, bờ đều, màu trắng đục. Bề mặt khuẩn lạc hơi lồi, bóng, đƣờng kính từ 6-8 µm × 5-6 µm. Tế bào S.boulardii (B) có dạng hình bầu dục.
Hình 3.1: A-Tế bào S.boulardii, B-Khuẩn lạc S.boulardii
26
3.1.2. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của S.boulardii
Biểu đồ 3.1 cho thấy, mật độ tế bào S.boulardii tăng liên tục và đạt cực đại ở 8.33 log (cfu/ml) vào giờ thứ 12 sau đó mật độ tế bào có xu hƣớng giảm dần, S.boulardii bắt đầu bƣớc vào pha ổn định rồi pha suy vong. Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi dừng quá trình nuôi cấy ở giờ thứ 12 để thu sinh khối nấm men.
Biểu đồ 3.1. đƣờng cong sinh trƣởng của S.Bouladii trên môi trƣờng Hasnsen 7.0 7.4 7.8 8.2 8.6 9.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 L og CF U/m l
27
3.2. Vi bao S.boulardii bằng Natri alginate có bổ sung gelatin (G) 3.2.1. Cấu trúc hạt vi bao 3.2.1. Cấu trúc hạt vi bao
Hình 3.3A, T có hình tròn, mềm, màu trắng đục. có đƣờng kính khoảng 2.5 – 3 mm. cũng áp dụng phƣơng pháp nhỏ giọt, Prevost đã vi bao thành công probiotics (Lactobacillus casei ATCC 393)với kích thƣớc hạt là 2.5 mm [46]. Parthiban Muthukumarasamy đã vi bao Lactobacillus reuteri bằng alginate theo phƣơng pháp nhỏ giọt. Kết quả hạt vi bao có đƣờng kính 2-3 mm [32]. Nhƣ vậy so với những nghiên cứu trƣớc đó, đƣờng kính hạt vi bao trong nghiên cứu của chúng tôi to hơn. Điều này có thể do kích thƣớc đầu mũi ống tiêm của chúng tôi lớn hơn và tế bào nấm men có kích thƣớc lớn hơn tế bào lactic. Đồng thời khoảng cách từ ống tiêm xuống dung dịch CaCl2 và tốc độ khuấy khi nhỏ giọt cũng gây ảnh hƣởng đến kích thƣớc tế bào. Wunwisa Krasaekoopt và cộng sự (2004) đã vi bao Lactobacillus acidophilus 547, Bifidobacterium bifidum ATCC 1994, Lactobacillus casei 01 bằng phƣơng pháp nhỏ giọt sử dụng 3 vật liệu tƣờng gồm chitosan, natri alginate, poly-L-Lysine kết hợp với alginate. Kết quả cho thấy rằng phƣơng pháp vi bao hay bao phủ không ảnh hƣởng đến sự tồn tại của tế bào. Những loại vật liệu đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này không ảnh hƣởng đến kích thƣớc hạt, đƣờng kính của