Mục đích thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của gelatin (G) trong sự vi bao S. boulardii bằng Natri alginate.
23
Áp dụng phƣơng pháp nhỏ giọt dựa trên phƣơng pháp của Krasaekoopt và cộng sự [33] bổ sung alginate (2%) và CaCl2 (0,75%) [48].
Nhằm mục đích khảo sát khả năng sống sót của S.boulardii trong hạt vi bao có bổ sung gelatin vào dung dịch alginate. Mẫu có bổ sung gelatin 0.75% w/v đƣợc cho vào dung dịch alginate đã tiệt trùng. Bổ sung sinh khối S.boulardii (108 cfu/ml) vào dung dịch hỗn hợp alginate theo tỷ lệ dung dịch huyền phù/Natri alginate = 1/2. Đồng nhất dung dịch trên trong điều kiện lạnh 50
C, dùng kim tiêm tạo giọt trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,75% sau đó để ổn định 30 phút trong tủ lạnh 50
C. Lọc, rửa 1 lần nƣớc muối sinh lý (0.9%) và 1 lần nƣớc cất, để ráo và trữ ở điều kiện lạnh 350
C (mẫu không sấy) hoặc sấy đối lƣu (450C, 5 giờ) sau đó lƣu trữ ở điều kiện 350C (mẫu sấy) từ 0-12 ngày.
Xác định mật độ tế bào sống sót đƣợc phóng thích ra khỏi vi bao bằng cách cho hạt vi bao vào dung dịch đệm photphate (pH = 7.0 M)[25]. Bổ sung 1 g hạt vi bao vào 9 ml dung dịch đệm photphate trong 60 phút [25]. Sử dụng mẫu đối chứng là mẫu không bổ sung gelatin. Tiến hành trải đĩa kiểm tra mật độ tế bào sau 0, 3, 6, 9 và 12 ngày (đối với cả 2 mẫu). Đĩa petri chứa huyền phù nấm men đƣợc ủ ở 300C trong 48 giờ.
Xác định mật độ tế bào sống sót sau khi thử dịch giả lập dạ dày bằng cách cho 1g hạt tƣơi vào 10ml dung dịch giả lập dạ dày (0.08M HCl thêm 0.2% NaCl, pH=1.5) không có pepsin ở 370C lần lƣợt trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút [34]. Còn đối với hạt khô và hạt khô nghiền cân 0,063g cho vào 10ml dung dịch giả lập dạ dày lần lƣợt trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút. Sau đó tiến hành trãi đĩa kiểm tra mật độ tế bào.
Tƣơng tự tiến hành khảo sát khả năng tế bào sống sót trong dịch muối mật bằng cách cho các mẫu hạt ngâm trong giả lập dạ dày trong 60 phút sau đó cho vào giả lập dịch ruột (0.05 M KH2PO4, pH =7.25 có thêm 0.6% muối mật) trong 30, 60, 90 và 120 phút. [34].
Đánh giá mật độ tinh thể đƣợc đo bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (Miniflex gonio Meter, Nhật Bản) bức xạ Cu (30kv × 15mA). Thiết bị đƣợc vận hành ở chế độ liên tục trong khoảng thời gian 1°/phút và quét qua một loạt 2θ từ 10 đến 90°. Cân 2g alginate cho vào 25ml nƣớc cất khuấy đều sau đó đem tiệt trùng 121 trong 15 phút. Mẫu A: thêm 25ml nƣớc cất vô trùng vào bình chứa 2g alginate đã tiệt trùng. Mẫu B: tƣơng tự mẫu A nhƣng bổ sung thêm gelatin tỉ lệ 0.75%w/v, mẫu C: tƣơng tự mẫu B có bổ sung thêm sinh
24
khối S.boulardii (thu đƣợc từ 25ml dung dịch sinh khối). 3 mẫu A, B, C đƣợc đồng nhất ở 50C, dùng kim tiêm tạo giọt bơm trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,75% sau đó để ổn định 60 phút ở 50C [9]. Lọc, rửa 1 lần nƣớc muối sinh lý vô trùng (0.9%) và 1 lần nƣớc cất vô trùng, để ráo. Đem mẫu đi sấy khô ở 45 trong 5 giờ.
Phƣơng pháp tính CFU/g hạt tƣơi:
CFU/g =
Trong đó: N là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa (chỉ lấy các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và nồng độ pha loãng là liên tiếp nhau). n là số đĩa ở nồng độ pha loãng f. V là thể tích mẫu đƣa vào đĩa (ml). [14]
Sau đó sẽ đƣợc tính theo log.
1g hạt tƣơi sau khi sấy khô sẽ còn lại 0.063g hạt sấy (tƣơng đƣơng 0.063g hạt sấy nghiền). theo thí nghiệm chúng tôi tiến hành bao gói 50g dung dịch sau khi nhỏ giot còn 38g mẫu T, theo tỉ lệ tam xích thì 1g hạt tƣơi sẽ bằng 1.3ml dung dịch. Vậy mẫu ĐC =1.3ml.
Vậy: 1.3ml ĐC (tƣơng đƣơng 8 CFU) = 1g T = 0.063g S = 0.063g SN
Định hƣớng nghiên cứu: Theo những nghiên cứu về bao gói alginate bằng phƣơng
pháp nhỏ giọt trƣớc đây chúng tôi nhận thấy rằng việc việc bổ sung thêm chất bao từ protein giúp bảo vệ tế bào nấm men tốt hơn. Trong bài nghiên cứu này chúng tôi chú trọng làm rõ khả năng sống sót của việc bao gói nấm men S.boulardii bằng gel alginate có bổ sung chất bao là gelatin trong môi trƣờng giả lập dạ dày và dịch ruột. Việc lƣu trữu những mẫu bao gói theo thời gian cũng đƣợc chú trọng, chúng tôi tập trung lƣu trữ ở 2 điều kiện nhiệt độ 5 và 30 để so sánh xem nhiệt độ lƣu trữ nào tốt hơn. Đồng thời chúng tôi cũng nghiền mịn các mẫu hạt bao gói khô để xem xét khả năng sống sót và bảo quản của hạt bao gói. Đây là điểm mới của bài chúng tôi.
25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kiểm tra đặc tính sinh học của S.boulardii
3.1.1. Quan sát hình thái S.boulardii
Khuẩn lạc S.boulardii (A) có hình tròn, bờ đều, màu trắng đục. Bề mặt khuẩn lạc hơi lồi, bóng, đƣờng kính từ 6-8 µm × 5-6 µm. Tế bào S.boulardii (B) có dạng hình bầu dục.
Hình 3.1: A-Tế bào S.boulardii, B-Khuẩn lạc S.boulardii
26
3.1.2. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của S.boulardii
Biểu đồ 3.1 cho thấy, mật độ tế bào S.boulardii tăng liên tục và đạt cực đại ở 8.33 log (cfu/ml) vào giờ thứ 12 sau đó mật độ tế bào có xu hƣớng giảm dần, S.boulardii bắt đầu bƣớc vào pha ổn định rồi pha suy vong. Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi dừng quá trình nuôi cấy ở giờ thứ 12 để thu sinh khối nấm men.
Biểu đồ 3.1. đƣờng cong sinh trƣởng của S.Bouladii trên môi trƣờng Hasnsen 7.0 7.4 7.8 8.2 8.6 9.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 L og CF U/m l
27
3.2. Vi bao S.boulardii bằng Natri alginate có bổ sung gelatin (G) 3.2.1. Cấu trúc hạt vi bao 3.2.1. Cấu trúc hạt vi bao
Hình 3.3A, T có hình tròn, mềm, màu trắng đục. có đƣờng kính khoảng 2.5 – 3 mm. cũng áp dụng phƣơng pháp nhỏ giọt, Prevost đã vi bao thành công probiotics (Lactobacillus casei ATCC 393)với kích thƣớc hạt là 2.5 mm [46]. Parthiban Muthukumarasamy đã vi bao Lactobacillus reuteri bằng alginate theo phƣơng pháp nhỏ giọt. Kết quả hạt vi bao có đƣờng kính 2-3 mm [32]. Nhƣ vậy so với những nghiên cứu trƣớc đó, đƣờng kính hạt vi bao trong nghiên cứu của chúng tôi to hơn. Điều này có thể do kích thƣớc đầu mũi ống tiêm của chúng tôi lớn hơn và tế bào nấm men có kích thƣớc lớn hơn tế bào lactic. Đồng thời khoảng cách từ ống tiêm xuống dung dịch CaCl2 và tốc độ khuấy khi nhỏ giọt cũng gây ảnh hƣởng đến kích thƣớc tế bào. Wunwisa Krasaekoopt và cộng sự (2004) đã vi bao Lactobacillus acidophilus 547, Bifidobacterium bifidum ATCC 1994, Lactobacillus casei 01 bằng phƣơng pháp nhỏ giọt sử dụng 3 vật liệu tƣờng gồm chitosan, natri alginate, poly-L-Lysine kết hợp với alginate. Kết quả cho thấy rằng phƣơng pháp vi bao hay bao phủ không ảnh hƣởng đến sự tồn tại của tế bào. Những loại vật liệu đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này không ảnh hƣởng đến kích thƣớc hạt, đƣờng kính của hạt không đƣợc bao phủ là 1.62 mm thấp hơn đƣờng kính của hạt bao phủ là 1.89 mm trong những vi bao probiotics.
Hình 3.3B. hạt khô cứng, hình tròn và có màu vàng nâu. Theo thí nghiệm của Yoav Bashan và cộng sự (2002) sau khi sấy hạt vi bao ở 380C kích thƣớc hạt khoảng 100-200 µm. Đƣờng kính hạt trong nghiên cứu của Yoav Bashan to hơn so với đƣờng kính hạt thí nghiệm của chúng tôi và nhiệt độ sấy thấp hơn ít gây ảnh hƣởng đến cấu trúc hạt vi bao hơn [49].
28
Hình 3.2. Hình dạng của hạt bao gói trƣớc sấy (A) và sấy khô (B)
B A
29
3.2.2. Mật độ tinh thể của hạt bao gói
Mật độ tinh thể của 3 mẫu hạt vi bao: hạt bao alginate, hạt bao alginate có bổ sung gelatin và hạt bao S.boulardii bằng alginate có bổ sung gelatin đƣợc mô tả ở hình 3.3.
Để làm rõ mật độ kết tinh của các loại mẫu trong ma trận polymer, mô hình nhiễu xạ tia X của hạt bao alginate đƣợc thực hiện và so sánh với các hạt bao alginate có bổ sung gelatin và hạt bao S.boulardii bằng alginate có bổ sung gelatin. Dạng hạt bao của các mẫu đã đƣợc tiếp xúc với bức xạ Cu (30kv × 15mA) ở một góc rộng nhiễu xạ tia X (Miniflex gonio Meter, Nhật Bản). Các thiết bị đƣợc vận hành ở chế độ liên tục trong khoảng thời gian 1°/phút và quét qua một loạt 2θ từ 10 đến 90°. Sự hiện diện của các đỉnh cho thấy hạt bao có bổ sung thêm các thành phần khác (bổ sung galatinvà S.boulardii) vẫn còn giữ đƣợc trạng thái tinh thể so với mẫu A. Kết quả cho thấy sau khi sấy thì cấu trúc hạt gel alginate có phần biến đổi về tinh thể khi bổ sung gelatin (mẫu B có cấu trúc biến đổi so với mẫu A).Việc bổ sung S. boulardii vào vi bao bằng alginate có bổ sung gelatin không làm thay đổi mật độ kết tinh của hạt bao sau sấy (mẫu C không biến đổi nhiều so với mẫu B).
30
Hình 3.3. Cấu trúc tinh thể của mẫu bao gói alginate (A), mẫu bao gói alginate có gelatin
(B) và mẫu bao gói alginate có bổ sung vi sinh vật và geletine (C)
A
B
31
3.3. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng giả lập dịch dạ dày và môi trƣờng giả lập dịch ruột. và môi trƣờng giả lập dịch ruột.
3.3.1. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng giả lập dịch dạ dày
Mật độ tế bào thay đổi từ khi kết thúc quá trình nuôi cấy, sau vi bao và giảm mạnh sau khi đƣợc sấy đối lƣu. Khả năng sống sót của tế bào đƣợc phóng thích đƣợc thử trong điều kiện giả lập dạ dày trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút là giảm dần đối với các 4 mẫu.
Đối với mẫu ĐC, mật độ tế bào ban đầu là 8.33 (log cfu/g hạt), sau khi thử dung dịch giả lập dạ dày trong 30 phút giảm 1 log còn 7.65 (log cfu/g hạt). Mật độ tế bào tiếp tục giảm và so với ban đầu mật độ tế bào đã giảm đi 3.9 (log cfu/g hạt)
Sau vi bao mật độ tế bào giảm còn 8.3 (log cfu/g hạt) là do tổn thất trong quá trình tạo hạt vi bao và cấu trúc gel ở các mẫu không thể vi bao hết số tế bào nấm men. Cụ thể tổn thất này do dung dịch vi bao bị dính vào kim tiêm y tế và cốc chứa dung dịch đồng thời ở cuối quá trình tạo hạt lƣợng dung dịch còn lại ít nên khi đẩy dung dịch ra khỏi kim tiêm có tạo thành bọt khí. Mẫu T giảm 0.5 (log cfu/g hạt) so với khi chƣa thử trong dịch dạ dày. Sau khi sấy, do bị sốc nhiệt và mất nƣớc (trung bình độ ẩm ban đầu là 96.67%, sau sấy còn 10.56%) nên mật độ tế bào giảm đáng kể còn 7.32 (log cfu/g hạt). Sau khi thử giả lập dạ dày ở 120 phút mật độ tế bào giảm 0.3 (log cfu/g hạt).
Dƣới tác động của lực cơ học, các hạt vi bao khô đã đƣợc nghiền nhỏ. Cấu trúc hạt bị phá vỡ nên mật độ tế bào giảm mạnh còn 4.58 (log cfu/g hạt). Khi thử trong điều kiện giả lập dạ dày mật độ tế bào SN giảm đi 1.14 (log cfu/g hạt)
Theo nhóm tác giả (R.R. Mokarram và cộng sự; 2009) cũng tiến hành thử vi bao L. acidophilus và L.rhamnosus bằng alginate trong môi trƣờng giả lập dạ dày (pH=1.5) trong 120 phút. Với L. acidophilus mật độ tế bào ban đầu 3.3x109 cfu/ml-1 sau khi thử môi trƣờng giả lập dạ dày sau 120 phút mật độ tế bào giảm mạnh còn 2.8 ± 0.2x104
cfu/ml-1 mẫu monolayer từ 2.3 0.4x109 cfu/ml-1 xuống còn 3.9 0.3x107 cfu/ml-1, mẫu bao gói 2 lớp từ mật độ tế bào lúc 0 giờ là 3.6 0.1x109 cfu/ml-1 giảm còn 1.7x108 cfu/ml-1. Tƣơng tự với L.rhamnosus mật độ tế bào ban đầu của các mẫu từ 1.2±0.1x109 – 8.2±0.1x109
cfu/ml- 1
, sau 120 phút thử ở môi trƣờng giả lập dạ dày thì mật độ tế bào của không vi bao giảm nhanh còn 1.3 ± 0.2x103 cfu/ml-1, mẫu bao gói 1 lớp còn 2.9 0.3x107 cfu/ml-1, mẫu bao gói 2 lớp giảm còn 2.7 1.8x107 cfu/ml-1 [34]. Xu hƣớng giảm nêu trên cũng đƣợc quan sát trong nghiên cứu của chúng tôi.
32
Nhƣ vậy, các mẫu bao gói khô và tƣơi cho mật độ tế bào cao hơn so với mẫu không vi bao và mẫu đã đƣợc nghiền nhỏ vì cấu trúc gel alginate bao bọc bảo vệ tế bào
S.boulardii bên trong nên tế bào ít chịu ảnh hƣởng của nhiệt độ và các điều kiện khác từ bên ngoài.
33
thoi gian (phut)
0 20 40 60 80 100 120 140 Log CFU/g hat 3 4 5 6 7 8 9
mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien
Biểu đồ 3.2. Mật độ tế bào S. boulardii sau khi thử dịch giả lập dạ dày theo thời gian 0, 30, 60, 90 và 120 phút. Kết quả đƣợc tính dựa trên giá trị trung bình (n=3) ± độ lệch chuẩn. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. Các chữ cái chỉ sự khác biệt có
nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05)
3.9: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu không đƣợc bao gói 0.5: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt tƣơi sau khi bao gói
S.boulardii
0.3: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii
đƣợc khi sấy ở 400
C trong 5 giờ
1.14: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 400C trong 5 giờ và nghiền.
0.5b
0.3c ccc
1.14d 3.9a
34
3.3.2. Đáng giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng dịch ruột
Khảo sát mật độ sống sót của tế bào S. boulardii chúng tôi tiến hành thử các mẫu trong dung dịch giả lập dạ dày trong 60 phút, sau đó thử tiếp giả lập dịch ruôt với 0.6% muối mật trong 2 tiếng (30, 60, 90 và 120 phút). Kết quả khảo sát cho thấy, sau khi thử muối mật thì tất cả các mẫu có xu hƣớng giảm mạnh, đặc biệt là ở mẫu ĐC, từ ban đầu gỉam đi 4log. Ở mẫu T, do đƣợc bao gói nên mật độ tế bào có giảm 0.59 (log cfu/g hạt) nhƣng vẫn ít hơn so với mẫu ĐC. Còn đối với mẫu S, giảm so với mật độ ban đầu 0 giờ là 0.38 (log cfu/g hạt). Đối với mẫu SN, mật độ ban đầu là 4.36 sau khi thử muối mật 1.97 (log cfu/g hạt) tức giảm 1.3 (log cfu/g hạt)
Theo (R.R. Mokarram và công sự, 2009) cũng tiến hành thử môi trƣờng giả lập dịch ruột (0.6% muối mật) trong 2 tiếng đối với Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus rhamnosus, kết quả cho thấy mật độ tế bào tự do của mẫu không vi bao giảm đáng kể so với các mẫu có bao gói. Đối với Lactobacillus acidophilus tế bào tự do là 5.6±2.3x109 cfu/ml-1 sau 2 tiếng thử môi trƣờng dịch ruột còn 2.2±0.4x102 cfu/ml-1, giảm 7.7 log (cfu/g), mẫu bao gói 1 lớp từ 5.7 ± 0.8x109 giảm còn 7.3 ± 0.7x105 cfu/ml-1, mẫu bao gói 2 lớp giảm còn 3.4 ± 0.9x106. Nhƣ vậy xu hƣớng tế bào giảm nêu trên cũng đƣợc quan sát trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi.
Theo (Murata và cộng sự, 1999) cũng tiến hành thí nghiệm với giả lập dịch ruột cũng cho kết quả tƣơng tự.
35
thoi gian (phut)
0 20 40 60 80 100 120 140 Log CFU/g hat 2 3 4 5 6 7 8 9
mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien
Biểu đồ 3.3. Mật độ tế bào S. boulardii sau khi thử dịch giả lập dạ dày theo thời gian 0, 30, 60, 90 và 120 phút. Kết quả đƣợc tính dựa trên giá trị trung bình (n=3) ± độ lệch chuẩn.
Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. Các chữ cái chỉ sự khác biệt có nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05)
4.01: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu đối chứng, mẫu không đƣợc bao gói
0.59: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt tƣơi sau khi bao gói S.boulardii
0.38: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 400
C trong 5 giờ
1.3: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 400
C trong 5 giờ và nghiền.
4.01a 0.38c 0.59b
36
3.4. Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lƣu trữ của hạt bao gói
Mật độ tế bào theo thời gian lƣu trữ ở theo nhiệt độ của các mẫu ĐC, T, S, SN thể