2.3.1. Phân tích vi sinh
Xác định số lƣợng tế bào nấm men bằng cách đếm số khuẩn lạc trên đĩa petri bằng kỹ thuật trải đĩa có môi trƣờng Hansen [44].
2.3.2. Phân tích hóa sinh
Xác định pH dung dịch đệm bằng máy đo pH Eutech instruments pH 510. Xác định độ ẩm bằng tủ sấy đối lƣu (theo AOAC 1984), sấy ở 1050C đến khối lƣợng không đổi. Hàm lƣợng protein gelatin đƣợc xác định bằng phƣơng pháp Micro-Kjeldahl [42]
Độ ẩm đƣợc xác định bằng phƣơng pháp sấy đối lƣu đến khối lƣợng không đổi 1050 C, sử dụng thiết bị sấy đối lƣu. Công thức xác định độ ẩm:
21 % Độ ẩm = 100 w w w f i i
Trong đó: wf, wi lần lƣợt là khối lƣợng của nguyên liệu trƣớc và sau quá trình sấy (AOAC, 1984).
2.3.3. Phƣơng pháp thống kê và xử lí số liệu
Dựa trên kết quả 3 lần thí nghiệm lặp lại. Xử lý kết quả bằng phần mềm Excel versions 2010 và IBM SPSS Statistics 20.
2.4. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.4.1. Quá trình chuẩn bị
Hoạt hóa S.boulardii ở 300C trong 24 giờ trong 10 ml môi trƣờng Hansen, tiếp đến chuyển toàn bộ sang bình có chứa 100 ml môi trƣờng Hansen nuôi cấy cùng điều kiện.. Quá trình nhân giống thực hiện trong điều kiện hiếu khí, sử dụng thiết bị khuấy từ với tốc độ 300 vòng/phút. Huyền phù sau lên men đƣợc ly tâm thành nhiều bình, mỗi bình chứa 100 ml huyền phù. Quy trình ly tâm cụ thể nhƣ sau: 100ml huyền phù đƣợc ly tâm một lần với tốc độ 4000 rpm trong 15 phút [39], sau đó bổ sung 100ml nƣớc muối sinh lý (0.9% NaCl ở 400C) đƣợc cho vào, trộn đều với cặn ly tâm và cũng ly tâm với tốc độ tƣơng tự. Quy trình rửa tế bào S. boulardii nói trên đƣợc rửa hai lần, một lần với nƣớc muối sinh lý và lần thứ hai với nƣớc cất (100ml), cuối cùng thu sinh khối và chuẩn bị cho vi bao.
Quá trình vi bao: chuẩn bị 2g alginate pha vào 25 ml nƣớc vô trùng ở khoảng 450C và hòa tan hoàn toàn bằng máy khấy từ ở 120 rpm sau đó đem tiệt trùng ở 121 trong 15 phút rồi làm nguội đến nhiệt độ phòng. Pha sinh khối S.boulardii (thu đƣợc từ 25 ml dung dịch sinh khối) vào 25 ml nƣớc cất vô trùng. Trộn dung dịch alginate vào dung dịch huyền phù. Đồng thời bổ sung thêm 0.75% w/v gelatin. Đồng nhất dung dịch trên ở 50
C, dùng kim tiêm tạo giọt bơm trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,75% sau đó để ổn định 60 phút ở 50C [9]. Lọc, rửa 1 lần nƣớc muối sinh lý vô trùng (0.9%) và 1 lần nƣớc cất vô trùng, để ráo => thu đƣợc hạt vi bao tƣơi (mẫu không sấy).
Quá trình sấy: hạt vi bao đƣợc sấy đối lƣu (450C trong 5 giờ) => hạt sấy
Một phần hạt sấy đƣợc đem đi nghiền mịn lọc qua ray có kích thƣớc lỗ No.56 (kích thƣớc mắt lƣới 308 m).
22
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng.
2.4.2. Khảo sát đặc tính sinh học
Mục đích thí nghiệm: kiểm tra tính thuần và hình dạng tế bào S.boulardii.
Tiến hành thí nghiệm: Giống S.boulardii (100mg) trong gói Bioflo của hãng Biocodex, Pháp đƣợc hoạt hóa 24 giờ ở 300C trong môi trƣờng Hansen. Cấy truyền
S.boulardii trên môi trƣờng thạch nghiêng, ủ 24 giờ ở 300C. Cấy giống thuần từ ống thạch nghiêng sang đĩa petri môi trƣờng Hansen (ủ 24 giờ, 300
C). Sau thời gian ủ, quan sát hình thái tế bào, chọn khuẩn lạc đặc trƣng quan sát trên kính hiển vi [28].Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng.
2.4.3. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của S.Boulardii
Mục đích thí nghiệm: chọn thời điểm thích hợp thu sinh khối cao nhất để kết thúc giai đoạn nhân giống.
Tiến hành thí nghiệm: Bằng cách chuyển giống cấp 1 từ ống thạch nghiêng sang ống nghiệm chứa 10 ml môi trƣờng Hansen lỏng, ủ 48 giờ ở 300
C. Chuyển giống cấp 2 từ ống nghiệm sang bình cầu 250 ml (thể tích giống 10%), trong điều kiện 300
C có khuấy lắc. Sau mỗi giờ lấy mẫu trải đĩa kiểm tra mật độ tế bào 1 lần. Đĩa đƣợc ủ ở 300C sau 48 giờ đếm số khuẩn lạc trên đĩa và tính mật độ tế bào theo công thức sau:
Mật độ tế bào =
x R
Trong đó: N là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa (chỉ lấy các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và nồng độ pha loãng là liên tiếp nhau). n là số đĩa ở nồng độ pha loãng f. V là thể tích mẫu đƣa vào đĩa (ml), R là độ chính xác. [14]
Dựa vào mật độ tế bào tính đƣợc dựng đƣờng cong sinh trƣởng của S.boulardii.
Các thí nghiệm đƣợc tiến hành trong điều kiện vô trùng.
2.4.4. Vi bao S.Boulardii với Natri Alginate có bổ sung gelatin
Mục đích thí nghiệm: khảo sát ảnh hƣởng của gelatin (G) trong sự vi bao S. boulardii bằng Natri alginate.
23
Áp dụng phƣơng pháp nhỏ giọt dựa trên phƣơng pháp của Krasaekoopt và cộng sự [33] bổ sung alginate (2%) và CaCl2 (0,75%) [48].
Nhằm mục đích khảo sát khả năng sống sót của S.boulardii trong hạt vi bao có bổ sung gelatin vào dung dịch alginate. Mẫu có bổ sung gelatin 0.75% w/v đƣợc cho vào dung dịch alginate đã tiệt trùng. Bổ sung sinh khối S.boulardii (108 cfu/ml) vào dung dịch hỗn hợp alginate theo tỷ lệ dung dịch huyền phù/Natri alginate = 1/2. Đồng nhất dung dịch trên trong điều kiện lạnh 50
C, dùng kim tiêm tạo giọt trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,75% sau đó để ổn định 30 phút trong tủ lạnh 50
C. Lọc, rửa 1 lần nƣớc muối sinh lý (0.9%) và 1 lần nƣớc cất, để ráo và trữ ở điều kiện lạnh 350
C (mẫu không sấy) hoặc sấy đối lƣu (450C, 5 giờ) sau đó lƣu trữ ở điều kiện 350C (mẫu sấy) từ 0-12 ngày.
Xác định mật độ tế bào sống sót đƣợc phóng thích ra khỏi vi bao bằng cách cho hạt vi bao vào dung dịch đệm photphate (pH = 7.0 M)[25]. Bổ sung 1 g hạt vi bao vào 9 ml dung dịch đệm photphate trong 60 phút [25]. Sử dụng mẫu đối chứng là mẫu không bổ sung gelatin. Tiến hành trải đĩa kiểm tra mật độ tế bào sau 0, 3, 6, 9 và 12 ngày (đối với cả 2 mẫu). Đĩa petri chứa huyền phù nấm men đƣợc ủ ở 300C trong 48 giờ.
Xác định mật độ tế bào sống sót sau khi thử dịch giả lập dạ dày bằng cách cho 1g hạt tƣơi vào 10ml dung dịch giả lập dạ dày (0.08M HCl thêm 0.2% NaCl, pH=1.5) không có pepsin ở 370C lần lƣợt trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút [34]. Còn đối với hạt khô và hạt khô nghiền cân 0,063g cho vào 10ml dung dịch giả lập dạ dày lần lƣợt trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút. Sau đó tiến hành trãi đĩa kiểm tra mật độ tế bào.
Tƣơng tự tiến hành khảo sát khả năng tế bào sống sót trong dịch muối mật bằng cách cho các mẫu hạt ngâm trong giả lập dạ dày trong 60 phút sau đó cho vào giả lập dịch ruột (0.05 M KH2PO4, pH =7.25 có thêm 0.6% muối mật) trong 30, 60, 90 và 120 phút. [34].
Đánh giá mật độ tinh thể đƣợc đo bằng phƣơng pháp nhiễu xạ tia X (Miniflex gonio Meter, Nhật Bản) bức xạ Cu (30kv × 15mA). Thiết bị đƣợc vận hành ở chế độ liên tục trong khoảng thời gian 1°/phút và quét qua một loạt 2θ từ 10 đến 90°. Cân 2g alginate cho vào 25ml nƣớc cất khuấy đều sau đó đem tiệt trùng 121 trong 15 phút. Mẫu A: thêm 25ml nƣớc cất vô trùng vào bình chứa 2g alginate đã tiệt trùng. Mẫu B: tƣơng tự mẫu A nhƣng bổ sung thêm gelatin tỉ lệ 0.75%w/v, mẫu C: tƣơng tự mẫu B có bổ sung thêm sinh
24
khối S.boulardii (thu đƣợc từ 25ml dung dịch sinh khối). 3 mẫu A, B, C đƣợc đồng nhất ở 50C, dùng kim tiêm tạo giọt bơm trực tiếp vào dung dịch CaCl2 0,75% sau đó để ổn định 60 phút ở 50C [9]. Lọc, rửa 1 lần nƣớc muối sinh lý vô trùng (0.9%) và 1 lần nƣớc cất vô trùng, để ráo. Đem mẫu đi sấy khô ở 45 trong 5 giờ.
Phƣơng pháp tính CFU/g hạt tƣơi:
CFU/g =
Trong đó: N là tổng số khuẩn lạc đếm đƣợc trên các đĩa (chỉ lấy các đĩa có số khuẩn lạc từ 25-250 và nồng độ pha loãng là liên tiếp nhau). n là số đĩa ở nồng độ pha loãng f. V là thể tích mẫu đƣa vào đĩa (ml). [14]
Sau đó sẽ đƣợc tính theo log.
1g hạt tƣơi sau khi sấy khô sẽ còn lại 0.063g hạt sấy (tƣơng đƣơng 0.063g hạt sấy nghiền). theo thí nghiệm chúng tôi tiến hành bao gói 50g dung dịch sau khi nhỏ giot còn 38g mẫu T, theo tỉ lệ tam xích thì 1g hạt tƣơi sẽ bằng 1.3ml dung dịch. Vậy mẫu ĐC =1.3ml.
Vậy: 1.3ml ĐC (tƣơng đƣơng 8 CFU) = 1g T = 0.063g S = 0.063g SN
Định hƣớng nghiên cứu: Theo những nghiên cứu về bao gói alginate bằng phƣơng
pháp nhỏ giọt trƣớc đây chúng tôi nhận thấy rằng việc việc bổ sung thêm chất bao từ protein giúp bảo vệ tế bào nấm men tốt hơn. Trong bài nghiên cứu này chúng tôi chú trọng làm rõ khả năng sống sót của việc bao gói nấm men S.boulardii bằng gel alginate có bổ sung chất bao là gelatin trong môi trƣờng giả lập dạ dày và dịch ruột. Việc lƣu trữu những mẫu bao gói theo thời gian cũng đƣợc chú trọng, chúng tôi tập trung lƣu trữ ở 2 điều kiện nhiệt độ 5 và 30 để so sánh xem nhiệt độ lƣu trữ nào tốt hơn. Đồng thời chúng tôi cũng nghiền mịn các mẫu hạt bao gói khô để xem xét khả năng sống sót và bảo quản của hạt bao gói. Đây là điểm mới của bài chúng tôi.
25
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN 3.1. Kiểm tra đặc tính sinh học của S.boulardii
3.1.1. Quan sát hình thái S.boulardii
Khuẩn lạc S.boulardii (A) có hình tròn, bờ đều, màu trắng đục. Bề mặt khuẩn lạc hơi lồi, bóng, đƣờng kính từ 6-8 µm × 5-6 µm. Tế bào S.boulardii (B) có dạng hình bầu dục.
Hình 3.1: A-Tế bào S.boulardii, B-Khuẩn lạc S.boulardii
26
3.1.2. Khảo sát đƣờng cong sinh trƣởng của S.boulardii
Biểu đồ 3.1 cho thấy, mật độ tế bào S.boulardii tăng liên tục và đạt cực đại ở 8.33 log (cfu/ml) vào giờ thứ 12 sau đó mật độ tế bào có xu hƣớng giảm dần, S.boulardii bắt đầu bƣớc vào pha ổn định rồi pha suy vong. Từ kết quả khảo sát trên, chúng tôi dừng quá trình nuôi cấy ở giờ thứ 12 để thu sinh khối nấm men.
Biểu đồ 3.1. đƣờng cong sinh trƣởng của S.Bouladii trên môi trƣờng Hasnsen 7.0 7.4 7.8 8.2 8.6 9.0 0 2 4 6 8 10 12 14 16 L og CF U/m l
27
3.2. Vi bao S.boulardii bằng Natri alginate có bổ sung gelatin (G) 3.2.1. Cấu trúc hạt vi bao 3.2.1. Cấu trúc hạt vi bao
Hình 3.3A, T có hình tròn, mềm, màu trắng đục. có đƣờng kính khoảng 2.5 – 3 mm. cũng áp dụng phƣơng pháp nhỏ giọt, Prevost đã vi bao thành công probiotics (Lactobacillus casei ATCC 393)với kích thƣớc hạt là 2.5 mm [46]. Parthiban Muthukumarasamy đã vi bao Lactobacillus reuteri bằng alginate theo phƣơng pháp nhỏ giọt. Kết quả hạt vi bao có đƣờng kính 2-3 mm [32]. Nhƣ vậy so với những nghiên cứu trƣớc đó, đƣờng kính hạt vi bao trong nghiên cứu của chúng tôi to hơn. Điều này có thể do kích thƣớc đầu mũi ống tiêm của chúng tôi lớn hơn và tế bào nấm men có kích thƣớc lớn hơn tế bào lactic. Đồng thời khoảng cách từ ống tiêm xuống dung dịch CaCl2 và tốc độ khuấy khi nhỏ giọt cũng gây ảnh hƣởng đến kích thƣớc tế bào. Wunwisa Krasaekoopt và cộng sự (2004) đã vi bao Lactobacillus acidophilus 547, Bifidobacterium bifidum ATCC 1994, Lactobacillus casei 01 bằng phƣơng pháp nhỏ giọt sử dụng 3 vật liệu tƣờng gồm chitosan, natri alginate, poly-L-Lysine kết hợp với alginate. Kết quả cho thấy rằng phƣơng pháp vi bao hay bao phủ không ảnh hƣởng đến sự tồn tại của tế bào. Những loại vật liệu đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này không ảnh hƣởng đến kích thƣớc hạt, đƣờng kính của hạt không đƣợc bao phủ là 1.62 mm thấp hơn đƣờng kính của hạt bao phủ là 1.89 mm trong những vi bao probiotics.
Hình 3.3B. hạt khô cứng, hình tròn và có màu vàng nâu. Theo thí nghiệm của Yoav Bashan và cộng sự (2002) sau khi sấy hạt vi bao ở 380C kích thƣớc hạt khoảng 100-200 µm. Đƣờng kính hạt trong nghiên cứu của Yoav Bashan to hơn so với đƣờng kính hạt thí nghiệm của chúng tôi và nhiệt độ sấy thấp hơn ít gây ảnh hƣởng đến cấu trúc hạt vi bao hơn [49].
28
Hình 3.2. Hình dạng của hạt bao gói trƣớc sấy (A) và sấy khô (B)
B A
29
3.2.2. Mật độ tinh thể của hạt bao gói
Mật độ tinh thể của 3 mẫu hạt vi bao: hạt bao alginate, hạt bao alginate có bổ sung gelatin và hạt bao S.boulardii bằng alginate có bổ sung gelatin đƣợc mô tả ở hình 3.3.
Để làm rõ mật độ kết tinh của các loại mẫu trong ma trận polymer, mô hình nhiễu xạ tia X của hạt bao alginate đƣợc thực hiện và so sánh với các hạt bao alginate có bổ sung gelatin và hạt bao S.boulardii bằng alginate có bổ sung gelatin. Dạng hạt bao của các mẫu đã đƣợc tiếp xúc với bức xạ Cu (30kv × 15mA) ở một góc rộng nhiễu xạ tia X (Miniflex gonio Meter, Nhật Bản). Các thiết bị đƣợc vận hành ở chế độ liên tục trong khoảng thời gian 1°/phút và quét qua một loạt 2θ từ 10 đến 90°. Sự hiện diện của các đỉnh cho thấy hạt bao có bổ sung thêm các thành phần khác (bổ sung galatinvà S.boulardii) vẫn còn giữ đƣợc trạng thái tinh thể so với mẫu A. Kết quả cho thấy sau khi sấy thì cấu trúc hạt gel alginate có phần biến đổi về tinh thể khi bổ sung gelatin (mẫu B có cấu trúc biến đổi so với mẫu A).Việc bổ sung S. boulardii vào vi bao bằng alginate có bổ sung gelatin không làm thay đổi mật độ kết tinh của hạt bao sau sấy (mẫu C không biến đổi nhiều so với mẫu B).
30
Hình 3.3. Cấu trúc tinh thể của mẫu bao gói alginate (A), mẫu bao gói alginate có gelatin
(B) và mẫu bao gói alginate có bổ sung vi sinh vật và geletine (C)
A
B
31
3.3. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng giả lập dịch dạ dày và môi trƣờng giả lập dịch ruột. và môi trƣờng giả lập dịch ruột.
3.3.1. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng giả lập dịch dạ dày
Mật độ tế bào thay đổi từ khi kết thúc quá trình nuôi cấy, sau vi bao và giảm mạnh sau khi đƣợc sấy đối lƣu. Khả năng sống sót của tế bào đƣợc phóng thích đƣợc thử trong điều kiện giả lập dạ dày trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút là giảm dần đối với các 4 mẫu.
Đối với mẫu ĐC, mật độ tế bào ban đầu là 8.33 (log cfu/g hạt), sau khi thử dung dịch giả lập dạ dày trong 30 phút giảm 1 log còn 7.65 (log cfu/g hạt). Mật độ tế bào tiếp tục giảm và so với ban đầu mật độ tế bào đã giảm đi 3.9 (log cfu/g hạt)
Sau vi bao mật độ tế bào giảm còn 8.3 (log cfu/g hạt) là do tổn thất trong quá trình tạo hạt vi bao và cấu trúc gel ở các mẫu không thể vi bao hết số tế bào nấm men. Cụ thể tổn thất này do dung dịch vi bao bị dính vào kim tiêm y tế và cốc chứa dung dịch đồng thời ở cuối quá trình tạo hạt lƣợng dung dịch còn lại ít nên khi đẩy dung dịch ra khỏi kim tiêm có tạo thành bọt khí. Mẫu T giảm 0.5 (log cfu/g hạt) so với khi chƣa thử trong dịch dạ dày. Sau khi sấy, do bị sốc nhiệt và mất nƣớc (trung bình độ ẩm ban đầu là 96.67%, sau sấy còn 10.56%) nên mật độ tế bào giảm đáng kể còn 7.32 (log cfu/g hạt). Sau khi thử giả lập dạ dày ở 120 phút mật độ tế bào giảm 0.3 (log cfu/g hạt).
Dƣới tác động của lực cơ học, các hạt vi bao khô đã đƣợc nghiền nhỏ. Cấu trúc hạt bị phá vỡ nên mật độ tế bào giảm mạnh còn 4.58 (log cfu/g hạt). Khi thử trong điều kiện giả lập dạ dày mật độ tế bào SN giảm đi 1.14 (log cfu/g hạt)
Theo nhóm tác giả (R.R. Mokarram và cộng sự; 2009) cũng tiến hành thử vi bao L. acidophilus và L.rhamnosus bằng alginate trong môi trƣờng giả lập dạ dày (pH=1.5) trong 120 phút. Với L. acidophilus mật độ tế bào ban đầu 3.3x109 cfu/ml-1 sau khi thử môi trƣờng giả lập dạ dày sau 120 phút mật độ tế bào giảm mạnh còn 2.8 ± 0.2x104
cfu/ml-1 mẫu monolayer từ 2.3 0.4x109 cfu/ml-1 xuống còn 3.9 0.3x107 cfu/ml-1, mẫu bao gói 2 lớp từ mật độ tế bào lúc 0 giờ là 3.6 0.1x109 cfu/ml-1 giảm còn 1.7x108 cfu/ml-1. Tƣơng tự với L.rhamnosus mật độ tế bào ban đầu của các mẫu từ 1.2±0.1x109 – 8.2±0.1x109