3.2.1. Cấu trúc hạt vi bao
Hình 3.3A, T có hình tròn, mềm, màu trắng đục. có đƣờng kính khoảng 2.5 – 3 mm. cũng áp dụng phƣơng pháp nhỏ giọt, Prevost đã vi bao thành công probiotics (Lactobacillus casei ATCC 393)với kích thƣớc hạt là 2.5 mm [46]. Parthiban Muthukumarasamy đã vi bao Lactobacillus reuteri bằng alginate theo phƣơng pháp nhỏ giọt. Kết quả hạt vi bao có đƣờng kính 2-3 mm [32]. Nhƣ vậy so với những nghiên cứu trƣớc đó, đƣờng kính hạt vi bao trong nghiên cứu của chúng tôi to hơn. Điều này có thể do kích thƣớc đầu mũi ống tiêm của chúng tôi lớn hơn và tế bào nấm men có kích thƣớc lớn hơn tế bào lactic. Đồng thời khoảng cách từ ống tiêm xuống dung dịch CaCl2 và tốc độ khuấy khi nhỏ giọt cũng gây ảnh hƣởng đến kích thƣớc tế bào. Wunwisa Krasaekoopt và cộng sự (2004) đã vi bao Lactobacillus acidophilus 547, Bifidobacterium bifidum ATCC 1994, Lactobacillus casei 01 bằng phƣơng pháp nhỏ giọt sử dụng 3 vật liệu tƣờng gồm chitosan, natri alginate, poly-L-Lysine kết hợp với alginate. Kết quả cho thấy rằng phƣơng pháp vi bao hay bao phủ không ảnh hƣởng đến sự tồn tại của tế bào. Những loại vật liệu đƣợc sử dụng trong thí nghiệm này không ảnh hƣởng đến kích thƣớc hạt, đƣờng kính của hạt không đƣợc bao phủ là 1.62 mm thấp hơn đƣờng kính của hạt bao phủ là 1.89 mm trong những vi bao probiotics.
Hình 3.3B. hạt khô cứng, hình tròn và có màu vàng nâu. Theo thí nghiệm của Yoav Bashan và cộng sự (2002) sau khi sấy hạt vi bao ở 380C kích thƣớc hạt khoảng 100-200 µm. Đƣờng kính hạt trong nghiên cứu của Yoav Bashan to hơn so với đƣờng kính hạt thí nghiệm của chúng tôi và nhiệt độ sấy thấp hơn ít gây ảnh hƣởng đến cấu trúc hạt vi bao hơn [49].
28
Hình 3.2. Hình dạng của hạt bao gói trƣớc sấy (A) và sấy khô (B)
B A
29
3.2.2. Mật độ tinh thể của hạt bao gói
Mật độ tinh thể của 3 mẫu hạt vi bao: hạt bao alginate, hạt bao alginate có bổ sung gelatin và hạt bao S.boulardii bằng alginate có bổ sung gelatin đƣợc mô tả ở hình 3.3.
Để làm rõ mật độ kết tinh của các loại mẫu trong ma trận polymer, mô hình nhiễu xạ tia X của hạt bao alginate đƣợc thực hiện và so sánh với các hạt bao alginate có bổ sung gelatin và hạt bao S.boulardii bằng alginate có bổ sung gelatin. Dạng hạt bao của các mẫu đã đƣợc tiếp xúc với bức xạ Cu (30kv × 15mA) ở một góc rộng nhiễu xạ tia X (Miniflex gonio Meter, Nhật Bản). Các thiết bị đƣợc vận hành ở chế độ liên tục trong khoảng thời gian 1°/phút và quét qua một loạt 2θ từ 10 đến 90°. Sự hiện diện của các đỉnh cho thấy hạt bao có bổ sung thêm các thành phần khác (bổ sung galatinvà S.boulardii) vẫn còn giữ đƣợc trạng thái tinh thể so với mẫu A. Kết quả cho thấy sau khi sấy thì cấu trúc hạt gel alginate có phần biến đổi về tinh thể khi bổ sung gelatin (mẫu B có cấu trúc biến đổi so với mẫu A).Việc bổ sung S. boulardii vào vi bao bằng alginate có bổ sung gelatin không làm thay đổi mật độ kết tinh của hạt bao sau sấy (mẫu C không biến đổi nhiều so với mẫu B).
30
Hình 3.3. Cấu trúc tinh thể của mẫu bao gói alginate (A), mẫu bao gói alginate có gelatin
(B) và mẫu bao gói alginate có bổ sung vi sinh vật và geletine (C)
A
B
31
3.3. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng giả lập dịch dạ dày và môi trƣờng giả lập dịch ruột. và môi trƣờng giả lập dịch ruột.
3.3.1. Đánh giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng giả lập dịch dạ dày
Mật độ tế bào thay đổi từ khi kết thúc quá trình nuôi cấy, sau vi bao và giảm mạnh sau khi đƣợc sấy đối lƣu. Khả năng sống sót của tế bào đƣợc phóng thích đƣợc thử trong điều kiện giả lập dạ dày trong 0, 30, 60, 90 và 120 phút là giảm dần đối với các 4 mẫu.
Đối với mẫu ĐC, mật độ tế bào ban đầu là 8.33 (log cfu/g hạt), sau khi thử dung dịch giả lập dạ dày trong 30 phút giảm 1 log còn 7.65 (log cfu/g hạt). Mật độ tế bào tiếp tục giảm và so với ban đầu mật độ tế bào đã giảm đi 3.9 (log cfu/g hạt)
Sau vi bao mật độ tế bào giảm còn 8.3 (log cfu/g hạt) là do tổn thất trong quá trình tạo hạt vi bao và cấu trúc gel ở các mẫu không thể vi bao hết số tế bào nấm men. Cụ thể tổn thất này do dung dịch vi bao bị dính vào kim tiêm y tế và cốc chứa dung dịch đồng thời ở cuối quá trình tạo hạt lƣợng dung dịch còn lại ít nên khi đẩy dung dịch ra khỏi kim tiêm có tạo thành bọt khí. Mẫu T giảm 0.5 (log cfu/g hạt) so với khi chƣa thử trong dịch dạ dày. Sau khi sấy, do bị sốc nhiệt và mất nƣớc (trung bình độ ẩm ban đầu là 96.67%, sau sấy còn 10.56%) nên mật độ tế bào giảm đáng kể còn 7.32 (log cfu/g hạt). Sau khi thử giả lập dạ dày ở 120 phút mật độ tế bào giảm 0.3 (log cfu/g hạt).
Dƣới tác động của lực cơ học, các hạt vi bao khô đã đƣợc nghiền nhỏ. Cấu trúc hạt bị phá vỡ nên mật độ tế bào giảm mạnh còn 4.58 (log cfu/g hạt). Khi thử trong điều kiện giả lập dạ dày mật độ tế bào SN giảm đi 1.14 (log cfu/g hạt)
Theo nhóm tác giả (R.R. Mokarram và cộng sự; 2009) cũng tiến hành thử vi bao L. acidophilus và L.rhamnosus bằng alginate trong môi trƣờng giả lập dạ dày (pH=1.5) trong 120 phút. Với L. acidophilus mật độ tế bào ban đầu 3.3x109 cfu/ml-1 sau khi thử môi trƣờng giả lập dạ dày sau 120 phút mật độ tế bào giảm mạnh còn 2.8 ± 0.2x104
cfu/ml-1 mẫu monolayer từ 2.3 0.4x109 cfu/ml-1 xuống còn 3.9 0.3x107 cfu/ml-1, mẫu bao gói 2 lớp từ mật độ tế bào lúc 0 giờ là 3.6 0.1x109 cfu/ml-1 giảm còn 1.7x108 cfu/ml-1. Tƣơng tự với L.rhamnosus mật độ tế bào ban đầu của các mẫu từ 1.2±0.1x109 – 8.2±0.1x109
cfu/ml- 1
, sau 120 phút thử ở môi trƣờng giả lập dạ dày thì mật độ tế bào của không vi bao giảm nhanh còn 1.3 ± 0.2x103 cfu/ml-1, mẫu bao gói 1 lớp còn 2.9 0.3x107 cfu/ml-1, mẫu bao gói 2 lớp giảm còn 2.7 1.8x107 cfu/ml-1 [34]. Xu hƣớng giảm nêu trên cũng đƣợc quan sát trong nghiên cứu của chúng tôi.
32
Nhƣ vậy, các mẫu bao gói khô và tƣơi cho mật độ tế bào cao hơn so với mẫu không vi bao và mẫu đã đƣợc nghiền nhỏ vì cấu trúc gel alginate bao bọc bảo vệ tế bào
S.boulardii bên trong nên tế bào ít chịu ảnh hƣởng của nhiệt độ và các điều kiện khác từ bên ngoài.
33
thoi gian (phut)
0 20 40 60 80 100 120 140 Log CFU/g hat 3 4 5 6 7 8 9
mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien
Biểu đồ 3.2. Mật độ tế bào S. boulardii sau khi thử dịch giả lập dạ dày theo thời gian 0, 30, 60, 90 và 120 phút. Kết quả đƣợc tính dựa trên giá trị trung bình (n=3) ± độ lệch chuẩn. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. Các chữ cái chỉ sự khác biệt có
nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05)
3.9: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu không đƣợc bao gói 0.5: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt tƣơi sau khi bao gói
S.boulardii
0.3: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii
đƣợc khi sấy ở 400
C trong 5 giờ
1.14: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 400C trong 5 giờ và nghiền.
0.5b
0.3c ccc
1.14d 3.9a
34
3.3.2. Đáng giá khả năng tồn tại của S. boulardii trong môi trƣờng dịch ruột
Khảo sát mật độ sống sót của tế bào S. boulardii chúng tôi tiến hành thử các mẫu trong dung dịch giả lập dạ dày trong 60 phút, sau đó thử tiếp giả lập dịch ruôt với 0.6% muối mật trong 2 tiếng (30, 60, 90 và 120 phút). Kết quả khảo sát cho thấy, sau khi thử muối mật thì tất cả các mẫu có xu hƣớng giảm mạnh, đặc biệt là ở mẫu ĐC, từ ban đầu gỉam đi 4log. Ở mẫu T, do đƣợc bao gói nên mật độ tế bào có giảm 0.59 (log cfu/g hạt) nhƣng vẫn ít hơn so với mẫu ĐC. Còn đối với mẫu S, giảm so với mật độ ban đầu 0 giờ là 0.38 (log cfu/g hạt). Đối với mẫu SN, mật độ ban đầu là 4.36 sau khi thử muối mật 1.97 (log cfu/g hạt) tức giảm 1.3 (log cfu/g hạt)
Theo (R.R. Mokarram và công sự, 2009) cũng tiến hành thử môi trƣờng giả lập dịch ruột (0.6% muối mật) trong 2 tiếng đối với Lactobacillus acidophilus và Lactobacillus rhamnosus, kết quả cho thấy mật độ tế bào tự do của mẫu không vi bao giảm đáng kể so với các mẫu có bao gói. Đối với Lactobacillus acidophilus tế bào tự do là 5.6±2.3x109 cfu/ml-1 sau 2 tiếng thử môi trƣờng dịch ruột còn 2.2±0.4x102 cfu/ml-1, giảm 7.7 log (cfu/g), mẫu bao gói 1 lớp từ 5.7 ± 0.8x109 giảm còn 7.3 ± 0.7x105 cfu/ml-1, mẫu bao gói 2 lớp giảm còn 3.4 ± 0.9x106. Nhƣ vậy xu hƣớng tế bào giảm nêu trên cũng đƣợc quan sát trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi.
Theo (Murata và cộng sự, 1999) cũng tiến hành thí nghiệm với giả lập dịch ruột cũng cho kết quả tƣơng tự.
35
thoi gian (phut)
0 20 40 60 80 100 120 140 Log CFU/g hat 2 3 4 5 6 7 8 9
mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien
Biểu đồ 3.3. Mật độ tế bào S. boulardii sau khi thử dịch giả lập dạ dày theo thời gian 0, 30, 60, 90 và 120 phút. Kết quả đƣợc tính dựa trên giá trị trung bình (n=3) ± độ lệch chuẩn.
Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. Các chữ cái chỉ sự khác biệt có nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05)
4.01: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu đối chứng, mẫu không đƣợc bao gói
0.59: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt tƣơi sau khi bao gói S.boulardii
0.38: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 400
C trong 5 giờ
1.3: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 120 phút của mẫu hạt sau khi bao gói S.boulardii đƣợc khi sấy ở 400
C trong 5 giờ và nghiền.
4.01a 0.38c 0.59b
36
3.4. Khảo sát mật độ tế bào theo thời gian lƣu trữ của hạt bao gói
Mật độ tế bào theo thời gian lƣu trữ ở theo nhiệt độ của các mẫu ĐC, T, S, SN thể hiện trong biểu đồ 3.2. Sau thời gian lƣu trữ 12 ngày, mật độ tế bào ở các mẫu đều có xu hƣớng giảm. Giảm nhanh nhất đó là mẫu ĐC. Tuy nhiên mẫu S, SN có xu hƣớng giảm chậm hơn.
Ở hình A, ở nhiệt độ 5 , sau thời gian mật độ tế bào của các mẫu đều giảm. Tại thời điểm ban đầu mẫu ĐC và T không có sự khác biệt nhƣng sau 12 mẫu ĐC đặc biệt giảm mạnh 2.1 (log cfu/g hạt) sau 12 ngày lƣu trữ. Trong khi mẫu T và S giảm 1.2 (log cfu/g hạt). Mẫu SN, ban đầu mật độ tế bào là 4.58 sau 12 ngày còn 3.58 (log cfu/g hạt) tức giảm 1 log. Chúng tôi cho rằng quá trình bao gói thực hiện ở điều kiện nhiệt độ 5 ít làm ảnh hƣởng đến tế bào nên mật độ tế bào giữa mẫu ĐC và T không có sự khác biệt, tuy nhiên đối với mẫu S và SN thì sau quá trình sấy, do bị sốc nhiệt và mất nƣớc nên mật độ tế bào giảm, thêm vào đó dƣới tác động của lực cơ học trong quá trình nghiền hạt làm cho mật độ tế bào ở mẫu SN thấp.
Ở hình B, mẫu ĐC sau 12 ngày mật độ tế bào giảm 2.2 (log cfu/g hạt). Đối với mẫu T, mật độ tế bào khi ở nhiệt độ phòng là 8.3 (log cfu/g hạt), sau thời gian lƣu trữ giảm1.34 log còn 6.96 (log cfu/g hạt). Với mẫu S, SN mật độ tế bào giảm 1.28 và 1.32 (log cfu/g hạt).Đối với mẫu S mức độ giảm mật độ tế bào diễn ra tƣơng đối chậm hơn so với các mẫu khác, số tế bào bắt đầu giảm nhẹ sau khi ngâm 30 phút trong dịch dạ dày và giữ ổn định khi ngâm trong 90 phút, đến khi ngâm trong 120 phút thì mới tiếp tục giảm. So với nghiên cứu của R.R Mokarram (2009) thì khả năng sống sót sau khi ngâm hạt bao trong môi trƣờng giả lập dạ dày trong nghiên cứu của chúng tôi cao hơn. Nguyên nhân có thể đƣợc giải thích là do mật độ tế bào S. boulardii ban đầu trong nghiên cứu của chúng tôi là không quá cao (8.33 – 8.3 log cfu/g hạt).
Năm 2009, Xiao Yan Xi và cộng sự vi bao L.casei ATCC 393 bằng gelatin-alginate (tỷ lệ 2:1) theo phƣơng pháp nhỏ giọt, làm khô bằng cách cho khí thổi ở 40C, tỷ lệ tế bào sống khi vi bao L.casei ATCC 393 bằng gelatin-alginate (tỷ lệ 2:1) đạt 2.83x107 (cfu/g) (bằng 7.45 log cfu/g). Sau 1 tuần lƣu trữ giảm còn 6.32 x 105 (cfu/g) (bằng 5.8 log cfu/g) [34]. Nhƣ vậy xu hƣớng tế bào giảm nêu trên cũng đƣợc quan sát trong kết quả nghiên cứu của chúng tôi.
Từ kết quả trên việc lƣu trữ các mẫu ở nhiệt độ tủ lạnh 5 và nhiệt độ phòng 30 , chúng tôi nhận thấy rằng sau thời gian lƣu trữ thì mật độ tế bào giảm dần. Tuy nhiên lƣu
37
trữ ở nhiệt 5 thì mật độ tế bào của các mẫu giảm ít hơn so với khi lƣu trữ ở nhiệt độ phòng. Sự ổn định của các hạt bao bị ảnh hƣởng bởi nhiệt độ bảo quản và hoạt động của nƣớc, và thƣờng nhiệt độ bảo quản thấp dẫn đến sự ổn định tốt hơn, tùy thuộc vào loại vật liệu lõi bọc [13].
38
thoi gian (ngay)
0 2 4 6 8 10 12 14 Log CFU /g hat 3 4 5 6 7 8 9
mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien
thoi gian (ngay)
0 2 4 6 8 10 12 14 Log CFU/g hat 2 3 4 5 6 7 8 9
mau khong vi bao mau vi bao tuoi mau vi bao say mau vi bao say nghien
Biểu đồ 3.4: Mật độ tế bào S. boulardii theo thời gian lƣu trữ (0, 3, 6, 9 và 12 ngày) ở 50C (A) và 300C (B) của các mẫu không vi bao, hạt tƣơi, hạt sấy và hạt sấy nghiền. Kết quả đƣợc tính dựa
B A 1.2b 1.2c 2.1a 1d 1.28c 1.32d 2.2a 1.34b
39
trên giá trị trung bình (n=3) ± độ lệch chuẩn. Thanh sai số thể hiện giá trị độ lệch chuẩn. Các chữ cái chỉ sự khác biệt có nghĩa về mặt thống kê (p < 0.05)
2.1: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 12 ngày lƣu trữ ở 50
C của mẫu đối chứng, mẫu không đƣợc bao gói
1.2: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 12 ngày lƣu trữ ở 50C của mẫu hạt tƣơi sau khi bao gói S.boulardii
1.2: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 12 ngày lƣu trữ ở 50
C của mẫu hạt sau khi bao gói
S.boulardii đƣợc khi sấy ở 400C trong 5 giờ
1: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 12 ngày lƣu trữ ở 50C của mẫu hạt sau khi bao gói
S.boulardii đƣợc khi sấy ở 400C trong 5 giờ và nghiền.
2.2: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 12 ngày lƣu trữ ở 300C của mẫu đối chứng, mẫu không đƣợc bao gói
1.34: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 12 ngày lƣu trữ ở 300C của mẫu hạt tƣơi sau khi bao gói S.boulardii
1.28: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 12 ngày lƣu trữ ở 300C của mẫu hạt sau khi bao gói
S.boulardii đƣợc khi sấy ở 400C trong 5 giờ
1.32: Mức độ giảm số lƣợng tế bào sau 12 ngày lƣu trữ ở 300C của mẫu hạt sau khi bao gói
40
3.5. Khảo sát khả năng sống sót của S. boularddi trong môi trƣờng giả lập dạ dày và dịch ruột sau 12 ngày lƣu trữ của hạt bao gói dịch ruột sau 12 ngày lƣu trữ của hạt bao gói
3.5.1. Khảo sát khả năng sống sót của S. boularddi trong môi trƣờng giả lập dạ dày sau 12 ngày lƣu trữ của hạt bao gói sau 12 ngày lƣu trữ của hạt bao gói
Sau 12 ngày lƣu trữ ở nhiệt độ 5 và 30 , chúng tôi tiến hành thử các mẫu trong dung dịch giả lập dạ dày trong 120 phút. Mật độ tế bào của các mẫu đều giảm mạnh so với