L ỜI MỞ ĐẦU
2.1. Đối tượng, dụng cụ thiết bị và hóa chất, phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Đối tượng nghiên cứu
-Nguyên liệu sử dụng chiết tinh dầu trong nghiên cứu này là: lá Trầu không được trồng tại xã Nghĩa Thành, Suối Nghệ, huyện Châu Đức, tỉnh Bà Rịa –Vũng Tàu.
-Nguyên liệu tươi, không bị nấm mốc, đạt độtrưởng thành và không bị sâu bệnh.
2.1.2. Dụng cụ thiết bị và hóa chất a) Dụng cụ thiết bị a) Dụng cụ thiết bị
Bảng 2. 1: Bảng dụng cụ thiết bị
Thiết bị Số lượng Thiết bị Số lượng
Nồi inox dung tích 5 lít 1 Nhiệt kế 1
Ống sinh hàn ruột thẳng 1 Đũa thủy tinh 1
Bộ Clevenger 1 Phễu chiết (250ml) 1
Cân phân tích (0.001g) 1 Ống đong (500ml) 1
Bình định mức(500ml) 1 Erlen (150ml) 2
Tủ lạnh 1 Cốc thủy tinh (500ml,
250ml,100ml)
5
Bếp điện 1 Bóp cao su 1
Đĩa petri 20 Pipet ( 10ml, 5ml) 2 Giấy tròn kháng khuẩn 50 lỗ Ống nghiệm 20
Ống tiêm 1ml/1cc 3 Màng bọc thực phẩm 1 cuộn
b) Hóa chất: - Nước cất
- Na2SO4 khan
- Mueller Hinton Agar (MHA)
- DMSO 2%
- Tryptic Soy Broth (TSB)
- Potato Dextrose Agar (PDA)
- Mueller Hinton Broth (MHB)
- Tween 80 0,2% - I2 - KI - HCl 4N - FeCl3 20% - NaOH 10% - H2SO4đđ 2.1.3. Phương pháp nghiên cứu
Để đạt được mục đích đặt ra của đề tài, đề tài nghiên cứu dựa trên các bài báo
nghiên cứu khoa học khác, nội dung nghiên cứu như sau:
-Nghiên cứu chiết xuất tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơinước với các
điều kiện khảo sát là tỉ lệ dung môi/nguyên liệu, thời gian ngâm và thời gian chưng cất.
-Nghiên cứu phương pháp xác định chỉ tiêu hóa – lý của tinh dầu.
-Nghiên cứu thành phần hóa học chính trong tinh dầu trầu không dựa trên kết quả các bài nghiên cứu khoa học khác, nghiên cứu phương pháp sắc ký khí khối phổ GC/MS.
Như mục tiêu đề tài đã đưa ra thì phương pháp chiết xuất tinh dầu bằng phương
pháp chưng cất hơi nước cổđiển là phương pháp chiết xuất tinh dầu phổ biến nhất được
áp dụng nhiều nhất trong công nghiệp hiện nay.
2.2. Xử lý nguyên liệu
Lá Trầu không khi thu hoạch chọn lá già, tươi, đạt độtrưởng thành, không bị sâu bệnh, nấm mốc và được hái vào sáng sớm. Sau đó, đem đi rửa sạch, để ráo nước và cắt nhỏ. Đem đi cân chính xác 500g rồi cho vào nồi chưng cất.
2.3. Dự kiến quy trình chiết xuất tinh dầu trầu không
Thuyết minh quy trình:
Lá Trầu không được rửa sạch, cắt nhỏ sơ bộ, cho vào nồi chưng cất chứa nước cất, đậy kín, ngâm trong khoảng thời gian thích hợp.
Tiến hành chưng cất hỗn hợp nguyên liệu đã chuẩn bị. Hỗn hợp hơi nước và tinh dầu sẽ bay hơi và ngưng tụ nhờ ống sinh hàn, hỗn hợp được chứa trong cột của thiết bị Clevenger. Để yên tinh dầu và nước sẽ phân lớp, nước ở phía dưới và tinh dầu ở phía trên, khi cột đầy thì xả bớt phần nước ngưng đi, tinh dầu vẫn giữ lại trong cột ngưng tụ.
Khi thu tinh dầu ta nên bỏ một ít trước và sau khi thu, vì lượng tinh dầu đó còn lẫn một ít nước ngưng, sẽ làm tinh dầu bị lẫn tạp chất, không tinh khiết dẫn đến ảnh hưởng đến xác định hợp chất và công thức.
Thêm Na2SO4 khan vào bình chứa tinh dầu thô, vừa thêm vừa khuấy đều cho đến
khi các tinh thể Na2SO4 bắt đầu rời ra. Để yên cho đến khi tinh dầu nổi lên trên, rồi cho vào bình chiết, chiết lấy phần tinh dầu đã loại được nước.
Tinh dầu thu hồi được cho vào lọ tối màu, tránh ánh sáng chiếu vào. Các tia UV trong ánh sáng làm phá vỡ các phân tử, thúc đẩy hình thành các gốc tự do gây ảnh hưởng đến chất lượng tinh dầu.Khi tinh dầutiếp xúc với ánh sáng tia cực tím một sốchất trong tinh dầu tăng lên và một số chất giảm đi đáng kể.
2.4. Tiến hành khảo sát các yếu tốảnh hưởng đến hiệu suất tinh dầu 2.4.1. Khảo sát tỷ lệnước/nguyên liệu 2.4.1. Khảo sát tỷ lệnước/nguyên liệu
Mục đích: Nước có tác dụng thẩm thấu vào các mô nguyên liệu, sau đó sẽ hòa tan, khuếch tán và lôi cuốn các hợp chất hữu cơ trong tinh dầu, có tác dụng phá vỡ hệ keo trong tinh dầu, tạo điều kiện cho tinh dầu thoát ra ngoài dễ dàng. Nếu thể tích dung môi quá ít sẽ làm tinh dầu khuếch tán không tốt vào trong dung dịch làm cho thời gian chưng cất kéo dài và thời gian tiếp xúc nhiệt càng lâu thì tinh dầu sẽ ngả vàng chất lượng tinh dầu giảm xuống. Tỉ lệnước nhiều hay ít đều ảnh hưởng đến hiệu suất thu hồi
Hình 2. 2: Hệ thống chưng cất tinh dầu lá Trầu không tại phòng thí nghiệm
tinh dầu.
Thực nghiệm: Xác định lượng nước bổ sung vào khi ngâm nhằm đánh giá khảnăng phân ly tinh dầu trong nguyên liệu, đây là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến hiệu quả của quá trình chưng cất. Và xác định được lượng nước bổsung cũng quyết định thời gian chưng cất tối ưu của sản phẩm.
Thực nghiệm này được tiến hành với lượng nước/nguyên liệu theo đổi theo các tỉ lệ: 3/1; 4/1; 5/1; 6/1; 7/1.
Cách tiến hành: Cân 500g lá trầu đã xử lý sau đó cắt nhỏ, thêm vào đó lượng nước, trong đó tỷ lệnước/nguyên liệu thay đổi lần lượt là: 3/1; 4/1; 5/1; 6/1; 7/1(v/w). Ngâm trong khoảng 1 giờ nhằm tăng diện tích tiếp xúc giữa lá với môi trường nước thúc đẩy quá trình khuếch tán của tinh dầu. Sau đó, chuyển toàn bộ vào nồi chưng cất và lắp đặt hệ thống chưng cất hỗn hợp trong 4 giờ dưới áp suất khí quyển. Đọc thể tích tinh dầu thu được trong cột ngưng tụ (có chia vạch thể tích) và so sánh thể tích tinh dầu thu được ở những lần thay đổi thể tích khác nhau. Từđó, chọn tỷ lệnước/nguyên liệu tối ưu nhất.
2.4.2. Khảo sát thời gian ngâm hỗn hợp
Mục đích: Thời gian ngâm là một yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến thể tích tinh dầu thu được bởi sự thẩm thấu của nước hay sự khuếch tán của các cấu tử tinh dầu ra môi trường không thể thực hiện được tức thời, mà phải cần một khoảng thời gian nhất định.
Sau khi xác định tỉ lệnước/nguyên liệu thích hợp, dung dịch sẽđược ngâm chung với lá trầu.
Thực nghiệm: Xác định thời gian ngâm nhằm tìm ra thời gian mà lượng tinh dầu khi chưng cất được nhiều nhất
Thực nghiệm này được tiến hành theo thời gian ngâm thay đổi lần lượt là: 1h; 1,5h; 2h; 2,5h; 3h.
Cách tiến hành: Lấy 500g lá trầu đã xửlý sau đó cắt nhỏ, thêm vào một lượng nước với tỷ lệnước/nguyên liệu được chọn ở lô thực nghiệm này là: 4/1 (v/w). Sau đó ngâm nguyên liệu trong các giờ cần khảo sát (mỗi giờ làm một mẻ riêng) và chuyển vào nồi chưng, lắp hệ thống chưng cất hỗn hợp trong 4 giờdưới áp suất khí quyển. Hỗn hợp sau khi được gia nhiệt sẽbay hơi và đi qua ống sinh hàn. Tại đây, tinh dầu ngưng tụ khi hơi gặp lạnh, rồi phân thành hai lớp: lớp trên là tinh dầu, lớp dưới là nước. Đọc thể tích
tinh dầu thu được trong cột ngưng tụ (có chia vạch thể tích) và so sánh thể tích tinh dầu thu được ở những lần thay đổi thời gian ngâm khác nhau. Từđó, chọn thời gian ngâm tối ưu nhất.
2.4.3. Khảo sát thời gian chưng cất hỗn hợp
Mục đích: thời gian chưng cất có vai trò quyết định lượng tinh dầu thu được. Nếu chưng cất trong thời gian quá ngắn thì lượng tinh dầu trích ly chưa hết hoàn toàn hay nó vẫn tồn tại trong tế bào, làm giảm thể tích tinh dầu thu được. Ngược lại, nếu chưng cất trong thời gian quá dài, thì vừa tốn thời gian, vừa tốn hao năng nượng và tinh dầu sẽ bị biến đổi màu lẫn mùi, chất lượng giảm đi rất nhiều.
Thực nghiệm: Xác định thời gian chưng cất nhằm tìm ra thời gian mà lượng tinh dầu khi chưng cất được nhiều nhất, tránh lãng phí thời gian nghiên cứu, cũng như tiêu hao điện khi gia nhiệt.
Thực nghiệm này được tiến hành theo thời gian chưng cất thay đổi lần lượt là: 180 phút; 210 phút; 240 phút; 270 phút; 300 phút.
Cách tiến hành: Lấy 500g lá trầu đã xửlý sau đó cắt nhỏ, thêm vào một lượng nước với tỷ lệnước/nguyên liệu được chọn ở lô thực nghiệm này là: 4/1 (v/w). Sau đó ngâm nguyên liệu trong 1,5 giờ đã chọn ở lô thực nghiệm trước và chuyển vào nồi chưng, lắp hệ thống chưng cất hỗn hợp trong 180 phút; 210 phút; 240 phút; 270 phút;
300 phút dưới áp suất khí quyển. Hỗn hợp sau khi được gia nhiệt sẽ bay hơi và đi qua ống sinh hàn. Tại đây, tinh dầu ngưng tụ khi hơi gặp lạnh, rồi phân thành hai lớp: lớp trên là tinh dầu, lớp dưới là nước. Đọc thể tích tinh dầu thu được trong cột ngưng tụ (có chia vạch thể tích) và so sánh thể tích tinh dầu thu được ở những lần thay đổi thời gian chưng cất khác nhau. Từđó, chọn thời gian chưng cất tối ưu nhất.
2.5. Phương pháp xác định một số chỉ số lí hóa của tinh dầu lá Trầu không 2.5.1. Đánh giá cảm quan 2.5.1. Đánh giá cảm quan
Phân tích sơ bộ chất lượng của tinh dầu bằng cảm quan dựa trên việc quan sát những dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc và độ trong suốt.
Màu sắc và độ trong suốt: xác định bằng cách cho tinh dầu vào một ống thủy tinh trong suốt không màu có dung tích 20 ml, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt. Nếu tinh dầu còn vẩn đục và không trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nước.
Mùi: là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tời giấy lọc hoặc bôi một ít vào mu bàn tay rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 – 30 mm, cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ. Ghi nhận xét về bản chất và cường độ mùi.
Vị: là một biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh dầu có vịriêng. Đểxác định vịdùng phương pháp nếm, nếm xong ghi nhận xét bản chất (ngọt, đắng, …) và cường độ vị (dịu, thoảng, …)
2.5.2. Xác định tỷ trọng
-Tỷ trọng của tinh dầu là tỷ số của khối lượng tinh dầu ở 25oC với khối lượng của cùng một thểtích nước cất cùng ở nhiệt độ 25oC.
Cách tiến hành: Cân ống tiêm có vạch chia chuẩn dung tích 1ml chính xác tới 0,001g được kết quả G. Lấy ống tiêm ra, hút nước cất vào đến vạch 0,1ml (chú ý trong quá trình tiến hành đừng để có bọt khí trong ống) đem ống tiêm ổn nhiệt ở 25oC khoảng 30 phút, đemđi cân được kết quả G1. Sau đó,đổ hết nước đi, vẩy cho khô. Hút tinh dầu vào ống tiêm cũng đến vạch 0,1ml. Đặt ống tiêm ổn nhiệt ở 25oC rồi đem cân được kết quả G2. Tiến hành 3 lần, ghi giá trị trung bình.
d =𝐺− 𝐺2 𝐺−𝐺1
G: Khối lượng của ống tiêm không, (g). G1: Khối lượng của ống tiêm khi có nước, (g). G2: Khối lượng của ống tiêm khi có tinh dầu, (g).
Sau khi xác định tỷ trọng của tinh dầu, tiến hành xác định một số chỉ số hóa lý. Các chỉ số đều được xác định trên tinh dầu vừa tách được.
2.6. Phương pháp định tính các thành phần trong dịch chiết lá Trầu không
Định tính Alkaloids
Cho vào ống nghiệm 3ml dịch chiết, sau đó cho từ từ thuốc thử theo thành ống nghiệm để yên, quan sát. Dùng thuốc thử Wagner.
Thuốc thử Wagner:
- I2 1,27g - KI 2 g
- H2O vừa đủ 100 ml
Nếu có alkaloid sẽ xuất hiện tủa màu nâu. Định tính Flavonoids
Cho 3 ml dịch chiết vào trong 2 ống nghiệm. Phương pháp này gồm thử nghiệm với dung dịch NaOH 10% và thử nghiệm với dung dịch FeCl3[11].
- Thử nghiệm NaOH 10%: Thêm 2 ml dung dịch NaOH 10% vào 3 ml hỗn hợp rồi lắc đều. Nếu thấy xuất hiện dung dịch màu vàng rồi chuyển sang không màu nếu cho acid hydrochloric vào chứng tỏ có sự hiện diện của flavonoids trong dịch chiết.
- Thử nghiệm FeCl3: Nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 bão hòa vào 3 ml hỗn hợp rồi lắc đều. Sự chuyển màu của dung dịch sang màu xanh đen chứng tỏ có tồn tại flavonoids trong dịch chiết. Định tính Anthraquinones Phản ứng Bomtra eger: - Dịch chiết 10ml - HCl 4N 4ml - FeCl3 20% 4ml
Lắc với 5ml ether, lấy lớp dịch ở trên. Hút 1ml dịch vừa chiết được cho vào ống nghiệm, thêm từ từ từng giọt đến hết 1ml dung dịch NaOH 10% lắc nhẹ. Phản ứng dương tính khi lớp kiềm có màu đỏ sim.
Định tính Steroid
Cho 3 ml dịch chiết vào trong 2 ống nghiệm. Phương pháp này thử nghiệm với thuốc thử Salkowski.
Thuốc thử Salkowski: H2SO4 đậm đặc, nhỏ từ từ vào 3ml dịch chiết Nếu xuất hiện màu đỏđậm, xanh, xanh tím là phản ứng dương tính.
Định tính Saponin
- Thử nghiệm 1: Lấy 1ml dịch chiết cho vào 2 ml dung dịch NaCl rồi lắc đều sau đó hút 2 ml hỗn hợp cho vào ống nghiệm rồi thêm 3 giọt máu động vật bằng ống tiêm rồi nhẹ nhàng đảo ngược ống (không tạo rung) và để yên trong 15 phút. Sự lắng xuống của các tế bào hồng cầu chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong dịch chiết [9].
- Thử nghiệm 2: Lấy 3ml dịch chiết hòa tan trong một ít nước cất sau đó lắc mạnh trong 30 giây và để yên hỗn hợp trong vòng 30 phút. Nếu có sự hình thành của bọt khí không tan chứng tỏ có sự hiện diện của saponin trong dịch chiết [9].
Định tính Tanin
Lấy 2ml dịch chiết hòa tan trong 10 ml dung dịch cồn 50%. Hút 4ml hỗn hợp vừa pha cho vào ống nghiệm:
- Thử nghiệm FeCl3: Nhỏ 3 giọt dung dịch FeCl3 vào phần thứ nhất, màu sắc của mẫu chuyển sang màu xanh lam hoặc màu xanh đen đậm chứng tỏ mẫu có tồn tại tannin [10].
2.7. Phương pháp xác định tỷ lệ khối lượng tinh dầu [5]
Tinh dầu sau khi chưng cất, để lắng hỗn hợp trong ống ngưng tụđến khi tách hẳn thành 2 pha riêng biệt. Pha nằm phía trên là tinh dầu, pha phía dưới là nước. Đọc thể tích tinh dầu trên ống ngưng tụ có vạch đo thể tích. Rồi tiến hành xác định tỉ lệ khối lượng tinh dầu tách chiết được.
Tỉ lệ khối lượng tinh dầu thu được theo công thức:
η = 𝑉𝑇𝐷 .𝑑𝑇𝐷
Trong đó:
η : Tỷ lệ khối lượng thu hồi tinh dầu (%) 𝑉𝑇𝐷 : thể tích tinh dầu thu được (ml)
𝑑𝑇𝐷 : tỷ trọng của tinh dầu (g/ml)
𝑚𝑁𝐿 : khối lượng nguyên liệu đem đi chưng (g)
2.8. Phương pháp xác định, định danh các cấu tử, thành phần hóa học có trong tinh dầu lá Trầu không tinh dầu lá Trầu không
Phát hiện sự có mặt của các cấu tử có trong tinh dầu lá Trầu không tại Viện Hàn Lâm Khoa Học Và Công Nghệ Việt Nam trên thiết bị sắc ký khí – ghép khối phổ. Việc định danh các thành phần trong tinh dầu được thực hiện bằng cách dùng phần mềm cài đặt sẵn trên máy để so sánh các phổ full-MS và MS/MS của từng cấu tử tách ra trên sắc ký đồ với các phổ chuẩn có trong thư viện phổ.
Mức độ phù hợp giữa các chất có trong mẫu nghiên cứu và chất đề nghịđược tính bằng đại lượng tương thích. Độ tương thích càng cao thì kết quả định danh càng chính xác. Khi phổ khối của một chất phân tích hoàn toàn giống với phổ khối của một chất