L ỜI MỞ ĐẦU
3.7. Kết quả xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinhd ầu bằng phương pháp
đo đường kính vòng kháng khuẩn
Khả năng kháng khuẩn được xác định dựa trên khả năng ức chế sự phát triển của vi khuẩn được thể hiện qua đường kính kháng khuẩn được tạo ra trên đĩa Petri được trình bày ở bảng 3.8.
Bảng 3. 11: Đường kính vòng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không (mm)
STT Nồng độ µl/ml B. cereus E. coli S. typhi S. areus P. aeruginosa 1 1024 8,33±1,11 3,00±0,00 3,5±0,5 4,33±1,11 5,33±2,44 2 512 5,33±1,55 2,67±0,44 2,5±0,5 2,33±0,44 3,00±0,0 3 256 5,00±1,00 1,00±0,00 - 2,33±0,44 1,00±0,00 4 128 4,00±0,67 - - 1,3±1,00 - 5 Tetracyclin 2,67±0,89 4,00±0,00 5,00±0,00 8,00±0,00 6,00 ±0,00 6 Ampicilin 7,33±0,44 4,00±0,00 - - 2,00±0,00 7 Amoxycilin - - - - 3,00±0,00 8 DMSO 2% + TWEEN 80 0,2% - - - - -
Theo bảng 3.8 khi đánh giá sơ bộ về khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không trên từng chủng vi khuẩn tôi rút ra một số nhận xét như sau:
1024 µl/ml có hoạt tính kháng khuẩncao nhất với kết quả là 8,33±1,11mm, hai nồng độ 512µl/ml và 256µl/ml không chênh lệch đáng kể kết quả lần lượt là 5,33±1,55 mm và 5,00±1,00mm. Nồng độ còn lại là 128µl/ml kết quả thu được là 4,00±0,67mm. Kết quả cho thấy hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu khôngđối với chủng B. cereus tương đối cao, nhận thấy tinh dầu lá Trầu không có khả năng kháng chủng này tốt kể cả ở nồng độ thấp. Hình 3. 3: Khảnăng kháng B. cereus của tinh dầu lá Trầu không (1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): Tetracyclin, (6): Ampicilin, (7): DMSO 2% + Tween 80 0,2%
Trên chủng vi khuẩn E. coli, sau khi tiến hành khảo sát thì nhận thấy ở hai nồng độ 1024µl/ml và 512µl/ml khả năng kháng khuẩn không chênh lệch nhiều, chỉ ở mức 3,00±0,00mm và 2,67±0,44 mm. Nồng độ 256µl/ml khả năng kháng chỉ đạt 1,00±0,00mm và không kháng ở nồng độ 128µl/ml. Qua kết quả cho thấy, hoạt tính kháng vi khuẩn E. colicủa tinh dầu lá Trầu không rất thấp so với các chủng vi khuẩn còn lại.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Trên chủng vi khuẩn S. typhi, sau khi tiến hành khảo sát ta nhận thấy tinh dầu lá Trầu không chỉ kháng được vi khuẩn S. typhiở hai nồng độ 1024µl/ml và 512µl/ml, kết quả lần lượt là: 3,5±0,5mm và 2,5±0,5mm. Còn ở nồng độ 256µl/ml và 128µl/ml thì không có khả năng kháng S. typhi. Như vậy, qua kết quả cho thấy khả năng kháng vi khuẩn S. typhi của tinh dầu lá Trầu không cũng rất kém.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Trên chủng vi khuẩn S. aureus, các nồng độ khảo sát giảm dần vòng kháng khuẩn lần lượt là: 1024 µl/ml ứng với 4,33±1,11mm, 512 µl/ml và 256 µl/ml có cùng vòng kháng là 2,33±0,44mm, 128 µl/ml ứng với 1,3±1,00mm. Qua kết quả cho thấy, khảnăng kháng vi khuẩn S. aureus của tinh dầu lá Trầu không thấp hơn B. cereus, nhưng cao hơn cả E. coli
và S. typhi.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3 loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Hình 3. 6: Khảnăng kháng S. aureus của tinh dầu lá Trầu không Hình 3. 5: Khảnăng kháng S. typhi của tinh dầu lá Trầu không
Trên chủng vi khuẩn P. aeruginosa có sựthay đổi vòng kháng rõ rệt hơn khi thay đổi nồng độ từcao đến thấp. Ở nồng độ cao nhất là 1024 µl/ml thì vòng kháng tương ứng là 5,33±2,44mm, nồng độ giảm xuống 512 µl/ml thì vòng kháng còn 3,00±0,0mm, nồng độ giảm thêm còn 256 µl/ml thì vòng kháng chỉ còn 1,00±0,0mm; nồng độ thấp nhất 128 µl/ml thì hoàn toàn không kháng được P. aeruginosa.
(1): 1024 µl/ml, (2): 512µl/ml, (3): 256µl/ml, (4): 128µl/ml, (5): chứng âm DMSO 2% + Tween 80 0,2%, (6): chứng dương gồm 3loại (a) Amoxylin, (b) Ampicilin, (c) Tetracyclin
Dựa trên kết quả thí nghiệm với DMSO 2% + Tween 80 0,2%, các mẫu chứng âm không xuất hiện vòng kháng khuẩn, điều này được khẳng định khi đa số các thí nghiệm về kháng khuẩn đều dùng DMSO làm chứng âm [10]. DMSO và Tween 80 dùng để phân tách tinh dầu ra nhỏ hơn để dễ dàng khuếch tán vào đĩa giấy. Vì vậy có thể kết luận rằng DMSO hòa tan đa số các hợp chất và sử dụng làm chứng âm với khuẩn mà không ảnh hưởng đến kết quả kháng khuẩn [12].
- Tinh dầu Trầu không có khảnăng kháng được 5 chủng vi khuẩn thử nghiệm. Mức độ kháng phụ thuộc vào nồng độ tinh dầu thử nghiệm. Hiệu quả kháng của tinh dầu Trầu không tốt nhất trên chủng B. cereus và thấp nhất trên chủng E. coli và S. typhi. Đối với S. aureus và P. aeruginosa mức độ kháng không cao so với B. cereus. Ở nồng độ thấp nhất (128µl/ml) thì hầu như không kháng được cả 3 chủng E. coli, S. typhi và P. aeruginosa; có kháng ở B. cereus và S. areus lần lượt là 4,00±0,67mm và 1,3,00±0,0mm.
-Ở nồng độ 1024µl/ml, hiệu quả kháng của tinh dầu Trầu không thấp hơn Tetracyclin mức 30µg, tương đương với Ampicilin mức 10µg và cao hơn Amoxylin mức 10µg.
CHƯƠNG 4: KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 4.1. Kết luận
Từ kết quả nghiên cứu tinh dầu lá Trầu không, tôi rút ra được một số kết luận sau:
- Qua quá trình thực nghiệm tôi đã xây dựng quy trình trích ly tinh dầu lá Trầu không kết hợp với các điều kiện thích hợp nhằm thu được lượng tinh dầu cao nhất như sau:
Tỷ lệnước/nguyên liệu 4/1 (v/w)
Thời gian ngâm 90 phút
Thời gian chưng cất 270 phút Tỷ lệ khối lượng tinh dầu lá Trầu không 0,27% (w/w)
- Bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước đã tách được tinh dầu lá Trầu không. Tinh dầu là một chất lỏng, có màu vàng nhạt, nhẹhơn nước và có tỷ trọng là 0,898g/cm3, mùi nồng, đặc trưng của tinh dầu Trầu không và vị cay.
- Dịch chiết lá Trầu không có chứa Flavonoid, Steroid, Anthraquinone, Saponin, Tanin.
- Bằng phương pháp sắc ký khí ghép khối phổGC/MS đã xác định được 25 cấu tử chính có trong tinh dầu. Trong thành phần chính của lá Trầu không là hợp chất Eugenol chiếm 33,142%.
- Kết quả khảo sát về hoạt tính kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không đối với các chủng vi khuẩn được thử nghiệm cho thấy ở nồng độ cao 1024µl/ml đạt đường kính vòng kháng khuẩn cao nhất ở 5 loại chủng vi khuẩn và ở nồng độ thấp nhất 128µl/ml thì tinh dầu lá Trầu không chỉ còn hoạt tính đối với B. cereus và S. areus, 3 chủng còn lại ở nồng độ thấp này không có hoạt tính kháng. Ngoài ra, ở nồng độ 1024µl/ml nhận thấy tinh dầu lá Trầu không có khảnăng kháng tốt hơn kháng sinh Amoxylin và tươngđương với Ampicilin, vẫn thấp hơn so với Tetracyclin.
4.2. Kiến nghị
-Các giống Trầu không ở nhiều nơi khác, điều kiện đất canh tác, mùa khô và mùa mưa, phương pháp bảo quản lá Trầu không ảnh hưởng tới hiệu suất trích ly tinh dầu bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước và thành phần của tinh dầu.
-Có thể nghiên cứu theo hướng mở rộng để xác định thành phần các chất có trong thân, rễ và hoa của Trầu không, so sánh với thành phần các chất có trong lá Trầu không. Từđó chọn ra nguồn nguyên liệu tối ưu nhất nhằm phục vụ cho việc nghiên cứu các hoạt tính sinh học để phục vụ cho ngành y học.
-Áp dụng các phương pháp mới vào quá trình trích ly như: chưng cất bằng nước muối NaCl, chưng cất bằng nước kết hợp với vi sóng, …
-Xác định tính chất vật lý khác của tinh dầu như: độ khúc xạ ánh sáng, góc quay cực.
-Xác định chỉ số hóa học của tinh dầu như: chỉ số acid, chỉ số este, chỉ số xà phòng hóa.
-Tìm hiểu thêm về quá trình làm sạch và tinh chế tinh dầu.
-Thử nghiệm thêm một số vi khuẩn khác đểđo độ kháng khuẩn của tinh dầu lá Trầu không
-Xác định khảnăng chống oxi hóa của tinh dầu lá Trầu không.
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
[1]. Nguyễn Nho Dũng, “Nghiên cứu chiết tách, xác định thành phần hóa học tinh dầu và dịch chiết từ lá Trầu không”, Tóm tắt luận văn Thạc sĩ khoa học, ĐH Đà Nẵng – 2011.
[2]. Huỳnh Kỳ Trân, Trần Nguyễn Ngọc Châu, Hà Mỹ Thuận, Nguyễn Khoa Nam, Đỗ Việt Hà, “Tinh dầu lá trầu Piper Betle.L và hoạt tính sinh học”, Tạp chí phân tích Hóa, Lý và Sinh học – Tập 20, số 3/2015
[3]. Nguyễn Thiện Chí, Nguyễn Thị Ngọc Châm, Phạm Khánh Ngọc, ĐỗDuy Phúc, Dương Tùng Kha, Nguyễn Thị Thu Thủy, “Khảo sát thành phần hóa học và hoạt tính kháng vi sinh vật của tinh dầu lá trầu không (Piper betle.L), họ hồ tiêu (Piperaceae)”, Tạp chí Khoa học Trường Đại học Cần Thơ, 2016, 45a: 28 - 32
[4]. Đỗ Tất Lợi (2004), “Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, Nhà xuất bản Y học.
[5]. Đoàn Ngọc Dũng, “Chiết xuất tinh dầu lá Bạch đàn bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước”, Đề tài nghiên cứu khoa học 2017, Trường ĐH Bà Rịa –Vũng Tàu
[6]. Bùi Thị Hồng Loan, “Khảo sát hoạt tính kháng khuẩn từ dịch chiết củ cải trắng”,
Đồ án tốt nghiệp 2017, Trường ĐH Bà Rịa –Vũng Tàu.
[7]. Nguyễn Thị Hoàng Lan, Bùi Quang Thuật, Lê Quang Tuyên, Nguyễn Thị Ngọc Duyên,
“Khả năng kháng khuẩn của tinh dầu lá tía tô”, Tạp chí Khoa học và Phát triển 2015, Tập 13, số 2: 245 – 250.
[8]. Nguyễn Thị Thắm, Phạm Kim Ngọc, Nguyễn Thị Minh Nguyệt, Đống Thị Anh Đào,
“Khảnăng kháng khuẩn và chống oxy hóa của dịch chiết củ cải trắng”, Tạp chí khoa học, Tập 46, số 2A (2017), tr.66 – 72.
[9]. Nguyễn Đức Lượng, Phạm Minh Tâm. 2012. Vệ sinh và an toàn thực phẩm. Nhà xuất bản Đại học Quốc gia Tp. HCM.
[10]. Phạm Hùng Vân, Phạm Thái Bình. 2013. Kháng sinh - Đề kháng kháng Sinh - Kỹ thuật kháng sinh đồ. Các vấn đề cơ bản thường gặp. Nhà xuất bản Y học, pp. 61 – 63.
TÀI LIỆU NƯỚC NGOÀI
[11]. Su, Pai-Wei, Yang, Cheng-Hong, Yang, Jyh-Femg, Su, Pei-Yu, Chuang, Li- Yeh,
2015, ‘Antibacterial Activities and Antibacterial Mechanism of Polygonum cuspidatum Extracts against Nosocomial Drug-Resistant Pathogens’, Molecules
2015, Vol. 20, pp. 11119 - 11130.
[12]. Yusuf, A. Z., Zarik, A., Shemau, Z., Abdullahi, M., Halima, S. A.
“Phytochemical analysis of the methanol leaves extract of Paullinia pinnata linn”, Journal of Pharmacognosy and Phytotherapy, Vol. 6, No. 2, pp. 10 - 16.
[13]. Senthilkumar, A., Venkatesalu, V.,2013, ‘Chemical constituents, in vitro antioxidant and antimicrobial activities of essential oil from the fruit pulp of wood apple’,
Industrial Crops and Products, Vol. 46, pp. 66 - 72.
TÀI LIỆU WEBSIDE
[14]. Lợi ích của cây Trầu. [Internet] Lấy từ URL:https://vietessence.com/san-pham/tinh- dau-trau-khong/
[15]. Ứng dụng của tinh dầu lá Trầu không. [Internet] Lấy từ URL: http://tld.vn/tinh-dau- trau-khong.html
[16]. Vi khuẩn Bacillus cereus. [Internet]. Lấy từ URL:
https://www.scribd.com/doc/33904341/Vi-khuan-Bacillus-cereus
[17]. Phương pháp hoạt tính sinh học. Trường Đại học Nông Lâm Thái Nguyên. [Internet]. Lấy từ URL: http://tuaf.edu.vn/khoacnsh/bai-viet/gioi-thieu-mot-so-phuong-phap-danh- gia-hoat-tinh-sinh-hoc-cac-hop-chat-thien-nhien-15658.html
[18]. Phương pháp chưng cất hơi nước. [Internet]. Lấy từ URL: