L ỜI MỞ ĐẦU
2.9. Phương pháp xác định hoạt tính kháng khuẩn của tinhd ầu bằng phương
pháp đo đường kính vòng kháng khuẩn [7]
- Môi trường: Môi trường tăng sinh và tồn trữ TSB, môi trường thử hoạt tính kháng khuẩn MHA.
- Chuẩn bị độ đục McFarland 0,5: độ đục này được chế bằng cách lấy 0,5ml BaCl2 0,48M trộn đều với 99,5ml H2SO4 0,35N; rồi phân chia ra các ống có đường kính tương tự các ống nghiệm chuẩn bị hỗn dịch vi khuẩn. Các ống này phải được hàn kín, đểở chỗ tối trong tủ lạnh và có thể sử dụng được trong vòng 6 tháng. Độđục này tương ứng với 108CFU/ml (Colony Forming Unit –đơn vị hình thành khuẩn lạc).
- Chuẩn bị dịch kháng khuẩn:
Dung dịch 2% tinh dầu: tinh dầu được hòa tan trong DMSO 2% và TWEEN 80 - 0,2% với các nồng độ khác nhau là: 1024 µl/ml, 512 µl/ml, 256 µl/ml, 128 µl/ml.
Dung dịch đối chứng dương gồm các kháng sinh: Ampicilin 10𝜇g/ml, Tetracyclin 30𝜇g/ml, Amoxilin 10𝜇g/ml.
- Chuẩn bị chủng vi sinh vật thử nghiệm:
Các loại vi khuẩn sử dụng xác định hoạt tính khángkhuẩn: gồm ba chủng Gram âm (Salmonella typhi - ATCC 14028, Pseudomonas aeruginosa - ATCC 9027,
Escherichia coli – ATCC 25922); và hai chủng Gram dương (Staphylococus aureus -
ATCC 6538, Bacillus cereus - VTCC 1005).
Cấy ria tạo khuẩn lạc trên môi trường thạch MHA, vi khuẩn được tồn trữ trong ống thạch nghiêng và bảo quản lạnh ở 40C. Từống tồn trữ, chọn 2 - 3 khuẩn lạc đưa vào ống nghiệm chứa 5ml môi trường TSB đã khử trùng, nuôi cấy tĩnh ở 370C (riêng
Staphylococcus aureus nuôi trong 24h). Huyền phù vi sinh vật sau đó được ly tâm tách sinh khối và pha loãng bằng nước cất vô trùng đến độđục tương đương 0,5 Mc Farland (nếu đục quá thì cho thêm nước cất, còn chưa đục thì cho thêm vi khuẩn), ta được hỗn dịch vi khuẩn khoảng 108CFU/ml.
- Tiến hành:
Dùng micropipet hút 100µl vi khuẩn mỗi loại (mật độ tế bào 108 CFU/ml), sau đó tiến hành cấy chang trên bề mặt đĩa thạch MHA, chờ khô bề mặt. Đĩa giấy 6mm vô trùng được thấm bão hòa dung dịch 2% tinh dầu và lấy ra đặt lên mặt thạch đã cấy chang vi khuẩn, đè nhẹđểđĩa giấy cốđịnh trên mặt thạch. Đĩa giấy ở giữa thấm dung dịch đối chứng âm, các đĩa xung quanh thấm dung dịch tinh dầu 2% và dung dịch đối chứng dương là kháng sinh. Chuyển các đĩa petri vào tủ lạnh (100C) khoảng 4 – 8 giờđể tinh dầu khuếch tán ra thạch. Sau đó đem nuôi ở 370C trong 16 – 18 giờ, riêng
Staphylococcus aureus nuôi trong 24giờ. Đọc kết quả và ghi nhận đường kính vòng vô khuẩn. Đường kính vòng vô khuẩn (D-d) được xác định bằng đường kính vòng kháng ngoài trừ đi đường kính đĩa giấy. Mỗi nồng độ được lập lại 3 lần. đường kính vòng kháng khuẩn được đo bằng đơn vị mm. [10]