bệnh sương mai, bệnh xoăn vàng lá trên các dòng cà chua nghiên cứu thông qua chỉ thị phân tử.
2.4.2.1Kiểm tra sự xuất hiện gene và allen của Ph3 trên các dòng, giống cà chua mới được chọn tạo thông qua chỉ thị phân tử.
Tách chiết DNA tổng số: DNA cà chua được tách chiết và tinh sạch theo quy trình cải tiến của Dorokhov và Klocke (1998) có điều chỉnh hoặc sử dụng Dneasy Plant kit của Quiagen. Chất lượng DNA được kiểm tra bằng kỹ thuật điện di trên gel agrose 1 % và mật độ quang (OD, A260/A280).
Thành phần dung dịch tách chiết DNA tổng số
Dung dịch A 200 mM Tris-HCl, pH 7.5 250mM Na2 EDTA
0.5% SDS Dung dịch B K-acetate 5M
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 40
Thành phần dung dịch đệm TE: 10mM Tris-HCl + 1mM EDTA pH=8
Quy trình tách chiết:
Bước 1: Lấy 0,1g mẫu tươi được ly trích từ lá non (của cây có 3-4 lá thật) cho vào ependoff 1.5ml (chứa 1 viên bi sắt) đã được đánh dấu, sau đó nghiền bằng máy lắc 20.000 vòng/ phút trong 1 phút. Bổ sung 300µl dung dịch A (dung dịch này
đã được làm nóng trước ở 650C) tiếp đó nghiền bằng máy tương tự như trên.
Bước 2: Bổ sung 300µl dung dịch A vào ependoff, lắc đều. Hỗn hợp được ủ ở 65oC, 15 phút trong bể ổn nhiệt (Water bath), 5 phút mix một lần.
Bước 3: Bổ sung 300µl dung dịch K- acetate 5M đảo đều. Sau đó đặt ngay vào đá lạnh trong 20 phút.
Bước 4: Tiến hành ly tâm 12.000vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Hút 500 µl dịch trong phía trên sang ống effendof 1.5ml mới.
Bước 5: Bổ sung 500 µl isopropanol (-20oC) lắc đều và để lạnh 4oC trong vòng 20 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 10 phút ở nhiệt độ phòng. Sau đó hút bỏ dịch trong, giữ lại phần kết tủa.
Bước 6: Rửa kết tủa bằng ethanol 70%
- Lần 1: Bổ sung 400 µl ethanol 70% để ở nhiệt độ thường khoảng 10 phút. Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó hút bỏ dịch trong, giũ lại phần kết tủa.
- Lần 2: Bổ sung 400 µl ethanol 70% để ở nhiệt độ thường khoảng 10 phút.
Ly tâm 12000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó hút bỏ dịch trong, giữ lại phần kết tủa. Tiếp đó làm khô bằng cách để eppendoff ở nhiệt độ phòng.
Bước 7: Hoà tan tủa bằng 30 µl dung dịch TE rồi bảo quản ở nhiệt độ -20oC cho đến khi thực hiện phản ứng PCR.
- Kiểm tra độ tinh sạch của DNA bằng phương pháp điện di trên gel agarose + Chuẩn bị gel agarose với nồng độ 1%: Cân 0.5g agarose cho vào 50ml dung dịch TAE 0.5X. Đun sôi bằng lò Viba ở bước sóng 650 W cho đến khi agarose tan hoàn toàn. Để nguội đến khoảng 600C.
+ Đổ gel, chờ agarose đông.
+ Load mẫu vào các giếng với tỷ lệ 1.5 µl loading dye và 4 µl DNA mẫu+ 2.5µl loading Star.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 41
+ Chạy điện di ởđiều kiện 70V, thời gian 30 phút.
+ Sau đó đưa vào máy Geldoc đọc kết quả. Nếu mẫu có DNA thì băng DNA sẽ
phát sáng dưới dạng vạch trên gel điện di. Độ tập trung và độđậm nhạt của băng điện di phản ánh độ tinh sạch và nồng độ cao hay thấp của mẫu DNA.
* Thực hiện phản ứng PCR với chỉ thị LB3 liên kết với gene Ph3 kháng bệnh sương mai:
- Phương pháp PCR với chỉ thị LB3:(Viện nghiên cứu rau quả) (5’ – GGT GAT CTG CAA AAT GAC TTGGG-3’; 3’ - AAG GTC TAA AGA AGG CCC GTG C 5’: Các thành phần tham gia vào phản ứng PCR được chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thành phần, hàm lượng của các chất trong mỗi phản ứng như
trong bảng sau Bảng 2.2: Thành phần các chất dùng cho mỗi phản ứng PCR với chỉ thị LB3 Hóa chất Thể tích (µl) H20 5.9 10X buffer 1.0 dNTP 1.0 Primer (Foreword) 0.5 Primer (Reverse) 0.5 Taq Polymerase 0.1 DNA template 1.0
Chương trình nhiệt cho phản ứng PCR
Số chu kỳ Nhiệt độ (0C) Thời gian
1 94 2 phút 35 94 30 giây 55 20 giây 72 2 phút 1 72 5 phút Bảo quản 4
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 42
- Điện di kiểm tra kết quả PCR:
Sau khi PCR, sản phẩm được cắt bằng enzym cắt hạn chế (Restriction enzym) MVAI ở 37oc trong 2h và điện di trên gel agarose 1.5% dưới hiệu điện thế
160V trong 90 phút. Sau đó, các băng DNA được quan sát dưới tia UV.
2.4.2.2 Kiểm tra sự xuất hiện gene và allen của Ty3 kháng bệnh xoăn vàng lá trên các dòng cà chua mới được chọn tạo thông qua chỉ thị phân tử.
Các mẫu cà chua được tách chiết DNA tổng số tương tự trên phương pháp nhưđối với mẫu bệnh sương mai .
Chỉ thị phân tử FLUW25 được dùng để xác định kiểu gene Ty 3 liên quan
đến tính chống bệnh xoăn vàng lá.
- Nguồn gốc của chỉ thịFLUW25(Ji, et al. 2007)
- Chỉ thị FLUW25: 5’- CAA GTG TGC TTA TAC TTC ATA TTC ACC 3’ 3’ – CCA TAT TTA CTT TCT ACT TCT ATT TCG AC 5’
* Điện di kiểm tra kết quả PCR
Bước 1: Chuẩn bị bản gel 1,5% agarose trong TAE 0,5X. Hòa tan hoàn toàn agarose trong TAE bằng đun sôi trong lò vi sóng. Để nguội đến khoảng 60oC, tiến hành đổ bản gel rồi để bản gel agarose đông hoàn toàn.
Bước 2: Chạy điện di:
Tra mẫu: trộn lẫn DNA và loading dye theo 6X theo tỷ lệ 5 và 1 sau đó tra hỗn hợp vào giếng. Chạy điện di ở hiệu điện thế 120V trong khoảng 30 phút.
Nhuộm bản gel với dung dịch edthidium bromide trong 30 phút. Hiển thị kết quảđiện di dưới tia UV, ghi lại hình ảnh điện di Phân tích kết quảđiện di.