giống bằng phương pháp lây nhiễm nhân tạo.
2.4.3.1 Lây bệnh nhân tạo với bệnh sương mai
Mẫu bệnh được thu thập tại Gia Viễn – Ninh Bình. Lá bệnh điển hình được thu thập và phân lập trên môi trường Pea agar, V8 agar, và PDA. Sau phân lập, nguồn bệnh
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 43
A B C
Hình 2.2: Quá trình phân lập nấm sương mai (A-mẫu bệnh, B- Phân lập trên môi trường V8, C- Hình dạng bọc bào tửđộng dưới kính hiển vi)
Tính kháng bệnh sương mai được đánh giá thông qua phương pháp là lây nhiễm nhân tạo trên lá tách rời. Sau khi gieo 30-35 ngày, cây xuất hiện 5-6 lá thật. Ngắt lá thật thứ 4 (đã phát triển đầy đủ), sạch bệnh và ghi thẻ đánh dấu tương ứng với mẫu giống nghiên cứu, giữ trong khăn ẩm, mát. Đặt úp lá cà chua lên môi trường thạch nước (Water agar: 18 g agar + 1000ml H2O, Autoclaved 1210C, 17 min.) trong đĩa Petri sau đó dùng Micropipet nhỏ vào giữa mỗi lá chét 30µl dung dịch bào tử (5000 sporangia/ml) nấm sương mai.Với mỗi mẫu giống lây bệnh được lặp lại 3 lần. Sau khi lây nhiễm, hộp petry được đậy kín lại, giữ trong tủđịnh ôn 170C. Đánh giá bệnh được thực hiện sau 7 ngày với 2 phương pháp: xác định số bào tử hình thành và chỉ số bệnh theo thang đánh giá như sau:
Điểm 1: Lá không xuất hiện vết bệnh; Điểm 2: Xuất hiện các chấm nhỏ trên lá (~1mm); Điểm 3: Khoảng 25% diện tích lá bị bệnh; Điểm 4: ~ 50% diện tích lá bệnh; Điểm 5: ~ 75% diện tích lá bệnh; Điểm 6: Hầu hết diện tích lá bị bệnh.
Các lá lây nhiễm sau khi đọc chỉ số bệnh sẽđược xác định số bào tử hình thành bằng kỹ thuật đếm bào tử dưới kính hiển vi với phân nhóm sau: ≤ 1 x 104 – kháng bệnh (R); 1,1 x 104 - 10 x 104 – Kháng trung bình (H); > 10 x 104 nhiễm bệnh (S).
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 44
Hình 2.3: Lây bệnh sương mai nhân tạo trên lá tách rời
2.4.3.2 Phương pháp lây bệnh nhân tạo và đánh giá tính kháng bệnh xoăn vàng lá
Sử dụng cấu trúc xâm nhiễm ToLCHnV (mã GenBank HQ162269) gây bệnh xoăn vàng lá trên cà chua tại Việt nam (Hà Viết Cường et al, 2011) để lây nhiễm nhân tạo bằng vi khuẩn Agrobacterum tumerfaciens. Vi khuẩn chứa cấu trúc xâm nhiễm với nồng độ 109 CFU/ml được tiêm với lượng 10 µl vào nách lá cây 5-6 lá thật.
Hình 2.4: Lây nhiễm nhân tạo bệnh virus xoăn vàng lá
Phương pháp nuôi cấy vi khuẩnAgrobacterum tumerfaciens:
- Cấu trúc xâm nhiễm sử dụng trong nghiên cứu được xây dựng từ một begomovirus gây bệnh trên cà chua của Việt Nam là Tomato leaf curl Hainan virus (ToLCHnV, mã GenBank HQ162269) (Hà Viết Cường et al., 2011). Đây là một begomovirus có bộ gen đơn và tạo triệu chứng xoăn vàng lá cà chua điển hình nên thích hợp cho các nghiên cứu đánh giá tính kháng.
Cấu trúc xâm nhiễm của virus được xây dựng trên vector chuyển gen thực vật dạng nhị nguyên là pCAMBIA2300 của Viện CAMBIA (http://www.cambia.org/ daisy/cambia/materials/vectors/585.html) và vi khuẩn E. coli chủng XL1-Blue.
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 45
- Cấu trúc xâm nhiễm, tiếp theo, được biến nạp vào tế bào vi khuẩn A. tumefacien chủng LBA4404. Dòng vi khuẩn A. tumerfacience mang cấu trúc xâm nhiễm được sử dụng để lây nhiễm nhân tạo.
- Dòng vi khuẩn A. tumefaciens chứa cấu trúc xâm nhiễm của ToLCHnV được nuôi cấy trong mL môi trường LB lỏng chứa 3 loại kháng sinh (streptomycin 100
µg/mL, rifampicin 50 µg/mL và kanamycin 50 µg/mL) trong tủ nuôi cấy có lắc (250 rpm / 28OC/ 1 ngày). Sau khi nuôi cấy, dịch vi khuẩn được ly tâm ở 3000 g / 5 phút và cặn vi khuẩn được hòa trong đệm MgCl2 (10 mM). Mật độ vi khuẩn được điều chỉnh ở 109 CFU/mL bằng đo mật độ quang học (OD, optical density) ở bước sóng 420 nm. Dịch vi khuẩn với mật độ 109 CFU/mL có giá trị OD420 = 0,9.
- Cây cà chua được lây nhiễm ở 28OC và giữ ở nhiệt độ này tối thiểu 2 ngày trước khi chuyển ra nhà lưới để theo dõi biểu hiện triệu chứng.
- Tính kháng bệnh được đánh giá sau lây nhiễm 30 ngày theo thang điểm: 0- không xuất hiện bệnh,
1-vàng nhẹở mép lá,
2-vàng và quăn nhẹở cuối lá chét,
3- vàng, quăn thể hiện rõ, lá co lại nhưng cây vẫn sinh trưởng, 4-cây vàng, xoăn, ngừng sinh trưởng.
Tính kháng bệnh theo chỉ số bệnh <1 kháng bệnh, từ 1-3 Chống chịu, > 3 nhiễm.