Chim yến đảo Khánh Hòa Aerodramus fuciphagus có kích thước rất nhỏ (chiều dài cơ thể: 12cm, trọng lượng cơ thể: 14,58 g) (Phach và cs, 2002). Nếu sử dụng phương pháp ngoáy lỗ niệu (như đối với các đối với các loài động vật lông vũ khác) sẽ làm tổn thương chim yến. Để khắc phục khó khăn này, chúng tôi tiến hành thu mẫu phân sau khi chim thải ra môi trường. Chim yến trên đảo được các cán bộ kỹ thuật bắt và cho vào lồng giấy đã được chuẩn bị sẵn, lồng chim có kích thước (30 x 30 x 30cm), đáy lồng có lót giấy đã được sấy khử trùng. Chim ở trong lồng khoảng 30 phút, thì hầu hết đều thải phân, tiến hành thu mẫu phân theo quy trình
của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE, 2008). Sau khi thu mẫu xong, thả chim về với tự nhiên.
Hình 2.1: Vị trí các đảo đã tiến hành thu mẫu phân chim yến
: nơi tiến hành lấy mẫu phân chim yến
Quy trình thu mẫu(theo quy trình của OIE, 2008)
Mẫu được thu ở hai vị trí. Vào trung tuần tháng 3, tiến hành thu mẫu lần đầu tại đảo A6 - Hòn Mun (12º09’51,7”Bắc; 109º18’56,5” Đông) cách bờ khoảng 10km với số lượng 10 mẫu. Mẫu được thu lần hai vào giữa tháng 5 tại đảo A1 - Hòn Ngoại (12°00’17,0”Bắc; 109°19’20,0” Đông) cách bờ khoảng 10 km với số lượng 20 mẫu. Hai đảo này cách nhau khoảng 18 km (theo đường chim bay) (Hình 2.1 và Bảng 2.1).
Dùng tăm bông vô trùng đã thấm môi trường vận chuyển quệt vào bãi phân mà chim yến vừa thải ra, thấy phân bám vào xung quanh đầu tăm bông là được. Thời gian tiếp xúc giữa mẫu phân và tăm bông khoảng 30 giây. Đặt tăm bông vừa
Đảo A6 (Hòn Mun)
Đảo A1 (Hòn Ngoại)
thu mẫu vào trong ống chứa môi trường. Ghi nhãn cho mẫu, điền đầy đủ thông tin (ngày thu mẫu, vị trí, ghi chú) vào bảng thông tin thu mẫu. Thu mẫu và kèm theo thu mẫu trắng. Bảo quản các ống mẫu trong thùng đá gel 4°C và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian thu mẫu
Ngày lấy mẫu Địa điểm Tọa độ Số lƣợng
15/03/2012 Đảo A6
(Hòn Mun ) 12º09’51,7”Bắc; 109º18’56,5” Đông 10
17/05/2012 Đảo A1
(Hòn Ngoại) 12°00’17,0”Bắc; 109°19’20,0” Đông 20
2.3.2 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu
Các mẫu phân chim yến đảo sau khi thu mẫu xong, được vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình vận chuyển mẫu chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như: thời gian vận chuyển, thành phần môi trường vận chuyển, thể tích ống chứa môi trường, nhiệt độ… Thời gian vận chuyển mẫu có thể kéo dài tùy thuộc vị trí các đảo thu mẫu: các đảo gần khoảng 2 - 3 giờ, các đảo ngoài khơi xa khoảng 5 - 6 giờ. Hơn nữa, mẫu được thu vào ban đêm khi đàn chim vừa đi kiếm ăn về, đến sáng hôm sau mới được vận chuyển về phòng thí nghiệm (12 giờ). Với các đảo ngoài tỉnh, thời gian vận chuyển khoảng 2 - 5 ngày. Trong khuôn khổ của đề tài, được biết nhóm nghiên cứu sẽ phải tiến hành thu mẫu ở những khu vực rất xa phòng thí nghiệm như Vũng Tàu, Phú Quốc (Kiên Giang) và Lào. Thời gian vận chuyển mẫu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình vận chuyển mẫu. Vì vậy ảnh hưởng đến kết quả kiểm nghiệm bằng phương pháp truyền thống. Vi sinh vật nhạy cảm như Salmonella, Vibrio… có thể chỉ tồn tại vài giờ sau khi thu mẫu. Mặt khác, các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh trưởng quá nhanh dẫn đến ức chế các vi khuẩn khác như Vibrio hoặc các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh trưởng quá nhanh và tiêu thụ hết chất dinh dưỡng đến pha suy vong. Môi trường vận chuyển lý tưởng là môi trường duy trì khả năng sống của vi khuẩn trong mẫu mà không thúc
đẩy vi khuẩn nhân lên. Thể tích ống chứa môi trường và thể tích môi trường trong ống ảnh hưởng đến lượng oxy trong ống để duy trì khả năng sống của vi sinh vật trong mẫu.
Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện vận chuyển với ba yếu tố: thời gian vận chuyển mẫu, thể tích ống đựng môi trường, môi trường vận chuyển mẫu.
Quy trình khảo sát điều kiện vận chuyển mẫ u
Điều kiện vận chuyển mẫu được khảo sát trên quy mô phòng thí nghiệm trên 3 loại môi trường khác nhau gồm nước muối sinh lý (NaCl 0.85%), nước muối sinh lý có bổ sung pepton 1%, và môi trường Carry - Blair. Yếu tố thể tích ống chứa mẫu cũng được khảo sát trên 2 loại dụng cụ khác nhau là eppendorf 1,5ml (chứa 1ml môi trường vận chuyển) và ống falcon 15ml (chứa 7ml môi trường vận chuyển).
Các chủng vi sinh vật được dùng để khảo sát môi trường là các vi sinh vật mục tiêu mà nhóm nghiên cứu cần kiểm định bao gồm E.coli, Salmonella spp.,
Vibrio spp. Bên cạnh đó, Lactobacillus acidophilus - vi khuẩn đường ruột có lợi cũng được bổ sung vào mẫu cần khảo sát (Bảng 2.2). Mật độ của các loại vi khuẩn được điều chỉnh để đạt độ đục 0,5 McFarland (dựa theo phương pháp xác định môi trường vận chuyển tối ưu của Gelmi và cộng sự năm 2000). Độ đục tiêu chuẩn 0,5 McFarland tương đương mật độ vi sinh vật khoảng 1,5 x 108
CFU/ml. Các ống mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4°C. Kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật mục tiêu trong các ống mẫu sau các khoảng thời gian 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 1 ngày, 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày. Thí nghiệm được lặp lại hai lần.
Bảng 2.2: Các chủng vi sinh vật sử dụng để khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu
Tên chủng Nguồn gốc Ký hiệu
E. coli ATCC 25922 (ATCC®) E1
Salmonella spp. PTN Vi sinh- Viện CNSH & MT S1
Vibrio spp. PTN Vi sinh- Viện CNSH & MT V1
2.3.3 Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật
Các vi sinh vật mục tiêu được phân lập dựa theo quy trình được xây dựng từ nhiều nguồn tham khảo khác nhau bao gồm tài liệu kiểm định vi sinh của Cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA - BAM), tài liệu “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm” của Trần Linh Thước (2002) và “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản của Bộ Thủy sản” (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2004).
Mẫu sau khi đem về phòng thí nghiệm, được pha loãng hai lần trong dung dịch SPW vô trùng, sau đó dịch pha loãng được cấy vào các môi trường canh thang tăng sinh chọn lọc và tăng sinh không chọn lọc tùy theo từng chỉ tiêu:
Đối với chỉ tiêu E.coli, mẫu được tăng sinh chọn lọc trong các ống nghiệm
chứa môi trường canh thang BGBL có ống durham. Các ống nghiệm được ủ ở 44°C trong 24 giờ. Chọn các mẫu dương tính (đục, sinh hơi) cấy ria sang môi trường chọn lọc EMB. Các khuẩn lạc tím đen có ánh kim được nhận định là E. coli. Làm
thuần các khuẩn lạc trên cùng môi trường chọn lọc sau đó đem đi kiểm tra các test sinh hóa.
Đối với chỉ tiêu Samonela, mẫu được tăng sinh trong dung dịch BPW, ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ. Sau đó, mẫu tiếp tục được tăng sinh chọn lọc ở môi trường RV, ủ ở 40°C trong 18 -24 giờ. Chọn các mẫu dương tính (đổi màu: trắng, đục) cấy ria sang môi trường chọn lọc XLD. Các khuẩn lạc trắng hồng, trong suốt, có tâm đen được nhận định là Salmonella. Làm thuần các khuẩn lạc trên cùng môi trường chọn lọc sau đó đem đi kiểm tra các test sinh hóa.
Đối với chỉ tiêu Vibrio, mẫu được tăng sinh chọn lọc trong dung dịch APW, ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ. Sau đó, mẫu được cấy trên môi trường tăng sinh chọn lọc TCBS, ủ ở 37°C trong 18 -22 giờ. Chọn các khuẩn lạc vàng hoặc xanh lục, to, có đường kính khoảng 2 - 3 mm hoặc 3 4 mm làm thuần các khuẩn lạc trên cùng môi trường chọn lọc sau đó đem đi kiểm tra các test sinh hóa.
Đối với chỉ tiêu vi nấm, mẫu được cấy trang trên môi trường SDA có bổ sung Chloramphenicol sao cho đạt nồng độ 0,05 g/l, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 -5 ngày. Quan sát các khuẩn lạc nấm mốc và nấm men (nếu có). Sau đó, đem soi kính hiển vi để quan sát hình thái.
Quy trình phân lập được thể hiện ở Hình 2.2
Hình 2.2: Sơ đồ quá trình phân lập vi sinh vật
Pha loãng Mẫu Chỉ tiêu nấm men nấm mốc tổng số Chỉ tiêu Vibrio spp. Chỉ tiêu Salmonella spp. Chỉ tiêu E.coli
Môi trường SDA ( 25°C, 4-5 ngày) Môi trường APW
( 37°C, 24 giờ) Môi trường BPW ( 37°C, 24 giờ) Môi trường BGBL ( 44°C, 24 giờ)
Giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh hóa
Định danh Quan sát hình thái Môi trường TCBS ( 37°C, 24 giờ) Môi trường RV ( 40°C, 24 giờ) Môi trường EMB
( 37°C, 24 giờ)
Môi trường XLD ( 37°C, 24 giờ)
2.3.4 Phƣơng pháp giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh hóa
Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập làm thuần được đem đi kiểm tra một số đặc tính bao gồm : Gram, tính di động, các phản ứng sinh hóa (khả năng lên men các loại đường: gồm lactose, glucose, sucrose, nhóm test IMViC (Indol, MR, VP, Citrate), sinh H2S, sinh hơi, catalase, urease, oxidase,… Các phản ứng sinh hóa được thực hiện bằng các môi trường thương mại hoặc tự pha theo thành phần để định danh theo phương pháp truyền thống (khóa phân loại vi sinh vật của Bergey). Sau đó, đặc biệt là đối với các chủng nghi ngờ có độc tính cao (Salmonella,
Vibrio… ), hệ thống định danh API 20E được sử dụng để định danh khẳng định vi
sinh vật. Ngoài ra, dựa vào các đặc điểm của vi sinh vật xác định bằng bộ kit API 20E kết hợp với một số đặc điểm khác (không có trong kit API 20E) dùng để xác định danh vi sinh vật bằng phần mềm ABIS.
2.3.4.1 Phƣơng pháp giám định hình thái và tính bắt màu
Để kiểm tra hình thái và tính bắt màu của các chủng vi khuẩn vừa phân lập được, ta sử dụng 2 phương pháp: kiểm tra nhanh vi khuẩn Gram âm bằng KOH và nhuộm Gram.
Phương pháp nhuộm Gram
Năm 1884, Hans Christian Joachim Gram - nhà khoa học người Đan Mạch đã sáng chế ra phương pháp nhuộm vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập được, tiến hành nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần . Vi khuẩn E. coli, Salmonella spp., Vibrio spp. đều là những trực khuẩn Gram âm
bắt màu đỏ (Quinn và cs, 1994).
Phương pháp kiểm tra nhanh Gram bằng KOH
Nhỏ 1 giọt KOH 3% lên phiến kính sạch, dùng que cấy lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cho vào vị trí có giọt KOH 3%. Dùng que cấy làm tan khuẩn lạc đưa que cấy lên, nếu có sợi tơ keo nhầy kéo theo là vi khuẩn Gram âm, nếu không có sợi tơ kéo theo là vi khuẩn Gram dương (Quinn và cs, 1994)
2.3.4.2 Phƣơng pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa
Các chủng vi khuẩn sau khi giám định hình thái, tiến hành kiểm tra một số test sinh hóa cơ bản sau:
Kiểm tra tính di động
Dùng que cấy thẳng vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấy một đường đâm sâu vào giữa ống chứa môi trường thạch mềm có bổ sung Triphenyltetrazolium chloride (TTC) nồng độ 0,05 g/l đến độ sâu khoảng 2 cm. Các ống được ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ, sau đó ủ tiếp ở 21 - 25°C đến 5 ngày. Đọc kết quả: nếu vi khuẩn tạo thành một vùng đục màu đỏ lan tỏa vào môi trường hai bên đường cấy thì kết quả dương tính, vi khuẩn có tính di động; nếu vi khuẩn chỉ tạo thành một đường màu đỏ dọc theo đường cấy thì kết quả âm tính, vi khuẩn không di động; ống đối chứng không có vi sinh vật tăng trưởng, môi trường trong (Trần Linh Thước, 2009)
Kiểm tra khả năng lên men đường
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấy vào các ống môi trường lỏng Phenol Red Broth Base có chứa các loại đường khác nhau (lactose, sucrose, mannitol, sorbitol). Sau khi cấy ủ các ống môi trường ở 37°C trong 18 - 20 giờ. Sau đó, tiến hành đọc kết quả: phản ứng dương tính khi môi trường màu đỏ chuyển sang vàng, phản ứng âm tính khi môi trường có màu đỏ (Trần Linh Thước, 2009).
Kiểm tra sinh hóa trên môi trường KIA
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy lên môi trường KIA: ria trên phần thạch nghiêng và đâm sâu xuống đáy ống nghiệm phần thạch đứng, ủ ở tủ ấm 37ºC, thời gian 18-24 giờ thì đọc kết quả. Môi trường KIA cho phép xác định được 4 tính chất: lên men đường glucose, lên men đường lactose, sinh hơi và sinh H2S (khả năng khử sulfate). Vi sinh vật có khả năng lên men đường glucose làm chuyển màu đỏ sang vàng trên phần thạch nghiêng. Phần thạch sâu đổi màu từ đỏ sang vàng khi vi sinh vật có khả năng lên men đường lactose. Các vi sinh vật có khả năng sinh hơi mạnh
sẽ làm thạch bị nứt hoặc đẩy thạch khỏi đáy ống nghiệm, các chủng sinh hơi yếu làm môi trường ống thạch xuất hiện bọt khí. Nếu ống nghiệm xuất hiện màu đen nghĩa là vi sinh vật mục tiêu có khả năng sinh H2S (Lassen, 1997).
Kiểm tra khả năng sinh Indol
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấ y vào môi trường lỏng Tryptone, ủ ở 37°C trong 24 - 48 giờ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac (p-Dimethylaminobenzaldehyde p-DMABA) vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút rồi đọc kết quả: nếu có sự xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt môi trường thì kết quả dương tính, vi khuẩn có khả năng sinh indol; nếu có sự xuất hiện của lớp màu vàng trên bề mặt môi trường thì kết quả âm tính, vi khuẩn không có khả năng sinh indol. Test sinh hóa này thử nghiệm khả năng sinh enzyme tryptophanase oxy hóa tryptophan thành sản phẩm có chứa gốc indol (Trần Linh Thước, 2009).
Phép thử Methyl Red (MR)
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấy vào môi trường lỏng MR - VP ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ. Thêm vài giọt thuốc thử Methyl red 0,02% vào trong ống dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay: nếu môi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử thì phép thử dương tính; nếu môi trường có màu vàng sau khi bổ sung thuốc thử thì phép thử âm tính; nếu môi trường có màu cam sau khi bổ sung thuốc thử, cần tiếp tục ủ ống môi tường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại phép thử. Phép thử MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền tro ng môi trường trong quá trình lên men glucose (Trần Linh Thước, 2009)
Phép thử Voges - Proskauer (VP)
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấy vào môi trường lỏng MR-VP, ủ ở 37°C trong 24 - 48 giờ hoặc đến 10 ngày khi cần thiết. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Thuốc thử có hai thành phần, nhỏ 6 giọt dung dịch A (α-naphthol 5% trong cồn tuyệt đối), sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B (KOH 40%). Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất là 4 giờ: nếu có màu đỏ trên bề mặt môi trường sau khi bổ sung thuốc thử thì phép thử
dương tính; nếu không đổi màu sau khi bổ sung thuốc thử thì phép thử âm tính. Phép thử VP có thể giúp phân biệt các loài trong Enterobacteriacease dựa trên sự oxi hóa acetoin từ 2,3-butanediol thành diacetyl (Trần Linh Thước, 2009).
Kiểm tra khả năng biến dưỡng citrate
Dùng que cấy vô trùng vô trùng lấy một ít khuẩn lạc chủng thuần cần kiểm tra, cấy ria trên bề mặt môi trường SCA. Sau khi ủ ở 35°C trong 24 - 48 giờ, tiến hành đọc kết quả: phép thử dương tính khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương, âm tính khi không xó khuẩn lạc và môi trường giữ nguyên màu xanh lục. Test sinh hóa này thử nghiệm khả năng sinh biến dưỡng citrate của vi sinh vật làm tăng pH của môi trường (Trần Linh Thước, 2009).
Kiểm tra Catalase
Dùng que cấy thẳng vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên khẩn lạc trên lam kính. Quan sát nếu có hiện tượng sủi bọt khí thì catalase dương tính, ngược lại nếu không có sủi bọt khí thì catalase âm tính. Test sinh hóa này thử nghiệm khả năng sinh emzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2Ovà O2, ngăn cản sự tích tụ H2O2 trong tế bào.