: nơi tiến hành lấy mẫu phân chim yến
Quy trình thu mẫu (theo quy trình của OIE, 2008)
Mẫu được thu ở hai vị trí. Vào trung tuần tháng 3, tiến hành thu mẫu lần đầu tại đảo A6 - Hịn Mun (12º09’51,7”Bắc; 109º18’56,5” Đơng) cách bờ khoảng 10km với số lượng 10 mẫu. Mẫu được thu lần hai vào giữa tháng 5 tại đảo A1 - Hịn Ngoại (12°00’17,0”Bắc; 109°19’20,0” Đơng) cách bờ khoảng 10 km với số lượng 20 mẫu. Hai đảo này cách nhau khoảng 18 km (theo đường chim bay) (Hình 2.1 và Bảng 2.1).
Dùng tăm bông vô trùng đã thấm môi trường vận chuyển quệt vào bãi phân mà chim yến vừa thải ra, thấy phân bám vào xung quanh đầu tăm bông là được. Thời gian tiếp xúc giữa mẫu phân và tăm bông khoảng 30 giây. Đặt tăm bơng vừa
Đảo A6 (Hịn Mun)
Đảo A1 (Hòn Ngoại)
thu mẫu vào trong ống chứa môi trường. Ghi nhãn cho mẫu, điền đầy đủ thông tin (ngày thu mẫu, vị trí, ghi chú) vào bảng thông tin thu mẫu. Thu mẫu và kèm theo thu mẫu trắng. Bảo quản các ống mẫu trong thùng đá gel 4°C và vận chuyển nhanh về phịng thí nghiệm.
Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian thu mẫu
Ngày lấy mẫu Địa điểm Tọa độ Số lƣợng
15/03/2012 Đảo A6
(Hịn Mun ) 12º09’51,7”Bắc; 109º18’56,5” Đơng 10
17/05/2012 Đảo A1
(Hịn Ngoại) 12°00’17,0”Bắc; 109°19’20,0” Đơng 20
2.3.2 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu
Các mẫu phân chim yến đảo sau khi thu mẫu xong, được vận chuyển về phịng thí nghiệm. Tuy nhiên, khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình vận chuyển mẫu chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như: thời gian vận chuyển, thành phần môi trường vận chuyển, thể tích ống chứa mơi trường, nhiệt độ… Thời gian vận chuyển mẫu có thể kéo dài tùy thuộc vị trí các đảo thu mẫu: các đảo gần khoảng 2 - 3 giờ, các đảo ngoài khơi xa khoảng 5 - 6 giờ. Hơn nữa, mẫu được thu vào ban đêm khi đàn chim vừa đi kiếm ăn về, đến sáng hôm sau mới được vận chuyển về phịng thí nghiệm (12 giờ). Với các đảo ngoài tỉnh, thời gian vận chuyển khoảng 2 - 5 ngày. Trong khuôn khổ của đề tài, được biết nhóm nghiên cứu sẽ phải tiến hành thu mẫu ở những khu vực rất xa phịng thí nghiệm như Vũng Tàu, Phú Quốc (Kiên Giang) và Lào. Thời gian vận chuyển mẫu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình vận chuyển mẫu. Vì vậy ảnh hưởng đến kết quả kiểm nghiệm bằng phương pháp truyền thống. Vi sinh vật nhạy cảm như Salmonella, Vibrio… có thể chỉ tồn tại vài giờ sau khi thu mẫu. Mặt khác, các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh trưởng quá nhanh dẫn đến ức chế các vi khuẩn khác như Vibrio hoặc các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh trưởng quá nhanh và tiêu thụ hết chất dinh dưỡng đến pha suy vong. Môi trường vận chuyển lý tưởng là mơi trường duy trì khả năng sống của vi khuẩn trong mẫu mà không thúc
đẩy vi khuẩn nhân lên. Thể tích ống chứa mơi trường và thể tích mơi trường trong ống ảnh hưởng đến lượng oxy trong ống để duy trì khả năng sống của vi sinh vật trong mẫu.
Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện vận chuyển với ba yếu tố: thời gian vận chuyển mẫu, thể tích ống đựng mơi trường, môi trường vận chuyển mẫu.
Quy trình khảo sát điều kiện vận chuyển mẫ u
Điều kiện vận chuyển mẫu được khảo sát trên quy mơ phịng thí nghiệm trên 3 loại môi trường khác nhau gồm nước muối sinh lý (NaCl 0.85%), nước muối sinh lý có bổ sung pepton 1%, và mơi trường Carry - Blair. Yếu tố thể tích ống chứa mẫu cũng được khảo sát trên 2 loại dụng cụ khác nhau là eppendorf 1,5ml (chứa 1ml môi trường vận chuyển) và ống falcon 15ml (chứa 7ml môi trường vận chuyển).
Các chủng vi sinh vật được dùng để khảo sát môi trường là các vi sinh vật mục tiêu mà nhóm nghiên cứu cần kiểm định bao gồm E.coli, Salmonella spp.,
Vibrio spp. Bên cạnh đó, Lactobacillus acidophilus - vi khuẩn đường ruột có lợi cũng được bổ sung vào mẫu cần khảo sát (Bảng 2.2). Mật độ của các loại vi khuẩn được điều chỉnh để đạt độ đục 0,5 McFarland (dựa theo phương pháp xác định môi trường vận chuyển tối ưu của Gelmi và cộng sự năm 2000). Độ đục tiêu chuẩn 0,5 McFarland tương đương mật độ vi sinh vật khoảng 1,5 x 108
CFU/ml. Các ống mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4°C. Kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật mục tiêu trong các ống mẫu sau các khoảng thời gian 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 1 ngày, 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày. Thí nghiệm được lặp lại hai lần.
Bảng 2.2: Các chủng vi sinh vật sử dụng để khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu
Tên chủng Nguồn gốc Ký hiệu
E. coli ATCC 25922 (ATCC®) E1
Salmonella spp. PTN Vi sinh- Viện CNSH & MT S1
Vibrio spp. PTN Vi sinh- Viện CNSH & MT V1
2.3.3 Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật
Các vi sinh vật mục tiêu được phân lập dựa theo quy trình được xây dựng từ nhiều nguồn tham khảo khác nhau bao gồm tài liệu kiểm định vi sinh của Cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA - BAM), tài liệu “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm” của Trần Linh Thước (2002) và “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản của Bộ Thủy sản” (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2004).
Mẫu sau khi đem về phịng thí nghiệm, được pha lỗng hai lần trong dung dịch SPW vơ trùng, sau đó dịch pha lỗng được cấy vào các mơi trường canh thang tăng sinh chọn lọc và tăng sinh không chọn lọc tùy theo từng chỉ tiêu:
Đối với chỉ tiêu E.coli, mẫu được tăng sinh chọn lọc trong các ống nghiệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
chứa mơi trường canh thang BGBL có ống durham. Các ống nghiệm được ủ ở 44°C trong 24 giờ. Chọn các mẫu dương tính (đục, sinh hơi) cấy ria sang môi trường chọn lọc EMB. Các khuẩn lạc tím đen có ánh kim được nhận định là E. coli. Làm
thuần các khuẩn lạc trên cùng mơi trường chọn lọc sau đó đem đi kiểm tra các test sinh hóa.
Đối với chỉ tiêu Samonela, mẫu được tăng sinh trong dung dịch BPW, ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ. Sau đó, mẫu tiếp tục được tăng sinh chọn lọc ở môi trường RV, ủ ở 40°C trong 18 -24 giờ. Chọn các mẫu dương tính (đổi màu: trắng, đục) cấy ria sang môi trường chọn lọc XLD. Các khuẩn lạc trắng hồng, trong suốt, có tâm đen được nhận định là Salmonella. Làm thuần các khuẩn lạc trên cùng môi trường chọn lọc sau đó đem đi kiểm tra các test sinh hóa.
Đối với chỉ tiêu Vibrio, mẫu được tăng sinh chọn lọc trong dung dịch APW, ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ. Sau đó, mẫu được cấy trên mơi trường tăng sinh chọn lọc TCBS, ủ ở 37°C trong 18 -22 giờ. Chọn các khuẩn lạc vàng hoặc xanh lục, to, có đường kính khoảng 2 - 3 mm hoặc 3 4 mm làm thuần các khuẩn lạc trên cùng mơi trường chọn lọc sau đó đem đi kiểm tra các test sinh hóa.
Đối với chỉ tiêu vi nấm, mẫu được cấy trang trên mơi trường SDA có bổ sung Chloramphenicol sao cho đạt nồng độ 0,05 g/l, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 -5 ngày. Quan sát các khuẩn lạc nấm mốc và nấm men (nếu có). Sau đó, đem soi kính hiển vi để quan sát hình thái.
Quy trình phân lập được thể hiện ở Hình 2.2