Các nghiên cứu về vi sinh trên đối tƣợng chim yến

1.3.1.1 Các nghiên cứu về chim yến trên thế giới

Các tài liệu khoa học và các nghiên cứu về chim yến trên thế giới rất ít và chủ yếu là các nghiên cứu của châu Âu. Dù chim yến là nguồn tài nguyên quý hiếm ở Châu Á nhưng các nghiên cứu của chim yến tại các nước đang sử dụng nguồn lợi này cũng rất hạn chế, chỉ có một số ít các nghiên cứu của Thái Lan, Malaysia, Indonesia. Các nghiên cứu chủ yếu tập trung vào giá trị dinh dưỡng và giá trị kinh tế của tổ yến. Gần đây đã bắt đầu có một số ít nghiên cứu về bảo tồn chim yến như di truyền, phân loại, tiến hóa như nghiên cứu của Price và Clayton (2004). Các nghiên cứu về bệnh học và vi sinh trên trên chim yến cho đến nay hầu như vẫn chưa có.

Tuy hệ vi sinh vật trên chim yến chưa được nghiên cứu nhưng Oktorina và cộng sự (2005) đã phát hiện thấy sự hiện diện của Staphylococcus aureus trên sản

phẩm tổ yến ở Indonesia bằng phương pháp hóa miễn dịch. Trong một nghiên cứu sơ bộ trước đó cũng của Oktorina, đã phát hiện Staphylococcus spp. có hiện diện

trong 5 mẫu tổ yến Indonesia trước khi xuất khẩu, trong khi đó Escherichia coli chỉ hiện diện trong 1 mẫu, còn Salmonella spp. và Pseudomonas spp. không được tìm thấy. Tuy nhiên kết quả nghiên cứu này không thể làm cơ sở để ta dự đoán hệ vi sinh vật ở chim yến vì có thể vi sinh vật trên nhiễm vào tổ yến trong quá trình thu hoạch hoặc chế biến và nghiên cứu cũng không nói rõ là tổ của loài chim yến nào.

1.3.1.2 Các nghiên cứu về chim yến ở Việt Nam

ứ . Đáng chú ý nhất là tài liệu chuyên khảo “The white-nest swiftlet and the black-nest swiftlet” c ủ

ộng sự (2002). Trong tài liệu này có nêu đầy đủ về đặc điểm sinh học, sinh sản, phân loại và tiến hóa, kỹ thuật nuôi và khai thác lấy tổ của 2 loài Yến hàng và Yến xiêm ở Việt Nam. Hầu hết các nghiên cứu về chim yến ở Việ

ến. Công ty Yến sào Khánh Hòa đã có nghiên cứu về chất dẫn dụ từ nguồn nguyên liệu phân chim yến. Công ty cũng nghiên cứu thành công kỹ thuật ấp nuôi nhân tạo chim Yến hàng; kỹ thuật chăm sóc chim con; xây dựng phương pháp cho chim bay. Đó là cơ sở khoa học cho việc phát triển đàn chim yến tăng số lượng cá thể trong quần đàn ở tỉnh Khánh Hòa để. Hiện nay, nhóm nghiên cứu của công ty Yến sào Khánh Hòa cũng đang tiến hành nghiên cứu sự khác nhau về hình thái của chim yến nhà và chim yến đảo phân bố ở Việt Nam”.

1.3.1.3 Các nghiên cứu về vi sinh trên đối tƣợng chim hoang dã

Mặc dù hệ vi sinh vật có vai trò quan trọng trong đời sống vật chủ nói chung và động vật lông vũ nói riêng; nhưng các nghiên cứu (trên thế giới và ở Việt Nam) về tỷ lệ nhiễm các vi khuẩn và các triệu chứng về sức khỏe chung của quần thể chim hoang dã còn hạn chế. Đặc biệt, đối với chim yến, một nguồn lợi to lớn có giá trị kinh tế của các nước Châu Á nói chung và của Việt Nam nói riêng, thì hầu như chưa có một nghiên cứu nào về hệ vi sinh vật và bệnh học trên loài chim quý này.

Các nghiên cứu về hệ vi sinh vật trên chim hoang dã còn hạn chế, tập trung vào các hướng chính:

a) Phân lập vi sinh vật từ gia cầm và các loài chim hoang dã và khảo sát hiện tượng kháng kháng sinh của các nhóm vi khuẩn ( Brittingham và cs, 1988; Sheldon, 1993; Lombardo và cs, 2000; Akhter, 2010).

b) Nghiên cứu bệnh truyền nhiễm và ngộ độc do vi khuẩn và mối tương quan nguyên nhân chính gây tử vong và suy giảm thể chất của các quần thể chim hoang dã (Hudson và Dobson, 1991; Pinowski và cs, 1991; Nuttall và cs, 1997). Tuy nhiên, những ảnh hưởng của vi sinh vật hiếm khi được xem xét trong

các nghiên cứu về sự sinh trưởng và phát triển của các loài chim hoang dã (O'Connor, 1984).

c) Nghiên cứu các ảnh hưởng của việc truyền nhiễm các vi khuẩn giữa các cá thể trong quần thể (giữa các bạn tình hoặc giữa cha mẹ và con cái) đến thể chất của cá thể và vai trò của vi sinh vật trong tiến hóa, tập tính học của quần thể (Troyer, 1982; Sheldon, 1993; Lockhart và cs, 1996).

1.3.2 Mục tiêu và tính cấp thiết của đề tài 1.3.2.1 Tính cấp thiết 1.3.2.1 Tính cấp thiết

Các loài chim hoang dã thường được xem là dấu hiệu để đánh giá độ đa dạng và trong lành của môi trường. Tuy nhiên, từ góc độ y tế cộng đồng, quan điểm tích cực này không hoàn toàn đúng (Jones, 2005). Ở một số nơi, chim hoang dã có thể gây ô nhiễm phân, ví dụ như các loài thủy cầm gây ra ô nhiễm phân tại các bể bơi, hồ tắm (Abulreesh và cs, 2004; Abulreesh và cs, 2005). Phân chim được xem như vector truyền bệnh - chúng có thể mang theo một lượng lớn tác nhân gây bệnh (virus, vi khuẩn, nấm và động vật nguyên sinh) phát tán trong một phạm vi rộng, các tác nhân gây bệnh này có thể được lây truyền sang người. Bản thân những con chim hoang dã này có thể đang bị bệnh hoặc khỏe mạnh nhưng là vật chủ trung gian truyền bệnh (Hubálek, 2004). Với khả năng bay lượn, di chuyển một khoảng cách xa, trong quá trình di cư hàng năm chim hoang dã có thể lây lan một số bệnh cho con người, các bệnh này có thể bùng phát trên diện rộng và trở thành dịch. Đối với các quần thể chim có mật độ đông, khả năng lây nhiễm vi sinh vật gây bệnh càng cao.

Chim Yến hàng sống bầy đàn với mật độ cao: ở các hang đáy khô có mật độ tổ 29,2 - 37,8 tổ/m2, còn các hang đáy nước có mật độ tổ 37,5 - 114,3 tổ/m2 (Phach và cs, 2002). Thêm vào đó, chim thường di chuyển xa để kiếm mồi. Với mật độ cao và khả năng di chuyển xa như vậy, khi trong đàn có một vài cá thể nhiễm bệnh, bệnh dịch có thể phát tán nhanh chóng trong quần thể; hoặc phát tán từ quần thể đảo này sang quần thể đảo khác; hoặc thậm chí có thể lây cho người. Điều này có thể làm giảm năng suất cho tổ của chim yến và đe dọa đến sức khỏe cộng đồng.

Chất thải của chim yến có thể gây ô nhiễm môi trường sống của toàn quần thể và đó cũng là nguồn lây nhiễm bệnh dịch từ cá thể bệnh sang cá thể khỏe. Đặc biệt, phân cũng có thể lẫn vào tổ yến, gây nhiễm bẩn sản phẩm tổ yến. Tuy các tổ yến thành phẩm đều qua quá trình sơ chế để đảm bảo không còn vi sinh vật gây bệnh, nhưng điều đó không đảm bảo việc loại hoàn toàn các độc tố do vi sinh vật sinh ra trước đó. Điều này có thể làm giảm chất lượng tổ yến và ảnh hưởng đến danh tiếng của yến sào Việt Nam. Ngoài ra, Công ty Yến sào Khánh Hòa còn thu chất thải của chim yến làm chất dẫn dụ chim yến. Một lượng lớn phân chim yến được sử dụng để tạo mùi cho các nhà yến mới. Nếu trong phân có vi sinh vật gây bệnh, điều này có thể vô tình làm phát tán bệnh dịch.

Từ những lý do trên, chúng tôi nghiên cứu “Bƣớc đầu khảo sát sự hiện diện của một số vi sinh vật có trong nguồn phân chim yến (Aerodramus fuciphagus) tại các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa”.

Đề tài giúp ta phần nào dự đoán được một số bệnh do vi sinh vật gây ra ở chim yến . Từ đó, đề ra phương pháp xử lý thích hợp nhất để bảo vệ và bảo tồn loài chim quý này. Đồng thời bổ sung các dữ liệu khoa học làm cơ sở cho việc quy hoạch và khai thác bền vững nguồn lợi chim yến Khánh Hòa. Đề tài này nằm trong dự án “An toàn và đa dạng sinh học chim yến” do Công ty yến sào Khánh Hòa phối hợp với Viện Công nghệ sinh học và môi trường - Trường Đại học Nha Trang thực hiện.

1.3.2.2 Mục tiêu

a) Mục tiêu của đề tài:

Nhằm khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật (tập trung chủ yếu vào các đối tượng Escherichia coli, Salmonella spp, Vibrio spp, nấm nen, nấm mốc) phân

lập từ phân chim yến đảo Khánh Hòa Aerodramus fuciphagus germani.

b) Nội dung nghiên cứu của dề tài:

- Khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu phân. Từ đó, tiến hành so sánh và đánh giá để chọn ra điều kiện vận chuyển tối ưu cho mẫu phân chim yến.

- Bước đầu khảo sát sự hiện diện của một số vi sinh vật (tập trung chủ yếu vào các đối tượng Escherichia coli, Salmonella spp, Vibrio spp, vi nấm) trong

nguồn phân chim yến Aerodramus fuciphagus trong khu vực các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa.

- Giám định hình thái và các đ ặc tính sinh hóa c ủa các chủng vi sinh vật phân lập được. Định danh các chủng vi sinh vật phân lập được bằng 2 phương pháp: Khóa phân loại Bergey và s ử dụng Kit API 20E.

CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu

- Chim yến đảo hoang dã Aerodramus fuciphagus trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa, thuộc quyền quản lý của Công ty Yến sào Khánh Hòa (SANEST).

- Thời gian nghiên cứu: từ 20/02/2012 đến ngày 02/06/2012.

2.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu

- Các loại hóa chất và môi trường nuôi cấy vi sinh của hãng Merk (Đức): BGBL, RV, Tryptone Water, MR - P V, SCA, Phenol Red Borth và các loại đường lactose, sucrose, mannitol, thanh thử oxidase ...

- Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh của hãng Himedia (Ấn Độ): Cary Blair, APW, BPW, EMB, TCBS, XLD, KIA, SDA…

- Sử dụng bộ Kit API 20E c ủa công ty BioMérieux (Pháp) và các thiết bị đi kèm như máy đo độ đục Densimat (BioMérieux - Pháp), máy định danh vi khuẩn mini API (BioMérieux - Pháp).

- Một số dụng cụ và thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm: Hộp lồng, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm, giá ống nghiệm, tủ cấy an toàn sinh học, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, máy vortex, …

2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu 2.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu

Chim yến đảo Khánh Hòa Aerodramus fuciphagus có kích thước rất nhỏ (chiều dài cơ thể: 12cm, trọng lượng cơ thể: 14,58 g) (Phach và cs, 2002). Nếu sử dụng phương pháp ngoáy lỗ niệu (như đối với các đối với các loài động vật lông vũ khác) sẽ làm tổn thương chim yến. Để khắc phục khó khăn này, chúng tôi tiến hành thu mẫu phân sau khi chim thải ra môi trường. Chim yến trên đảo được các cán bộ kỹ thuật bắt và cho vào lồng giấy đã được chuẩn bị sẵn, lồng chim có kích thước (30 x 30 x 30cm), đáy lồng có lót giấy đã được sấy khử trùng. Chim ở trong lồng khoảng 30 phút, thì hầu hết đều thải phân, tiến hành thu mẫu phân theo quy trình

của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE, 2008). Sau khi thu mẫu xong, thả chim về với tự nhiên.

Hình 2.1: Vị trí các đảo đã tiến hành thu mẫu phân chim yến

: nơi tiến hành lấy mẫu phân chim yến

Quy trình thu mẫu(theo quy trình của OIE, 2008)

Mẫu được thu ở hai vị trí. Vào trung tuần tháng 3, tiến hành thu mẫu lần đầu tại đảo A6 - Hòn Mun (12º09’51,7”Bắc; 109º18’56,5” Đông) cách bờ khoảng 10km với số lượng 10 mẫu. Mẫu được thu lần hai vào giữa tháng 5 tại đảo A1 - Hòn Ngoại (12°00’17,0”Bắc; 109°19’20,0” Đông) cách bờ khoảng 10 km với số lượng 20 mẫu. Hai đảo này cách nhau khoảng 18 km (theo đường chim bay) (Hình 2.1 và Bảng 2.1).

Dùng tăm bông vô trùng đã thấm môi trường vận chuyển quệt vào bãi phân mà chim yến vừa thải ra, thấy phân bám vào xung quanh đầu tăm bông là được. Thời gian tiếp xúc giữa mẫu phân và tăm bông khoảng 30 giây. Đặt tăm bông vừa

Đảo A6 (Hòn Mun)

Đảo A1 (Hòn Ngoại)

thu mẫu vào trong ống chứa môi trường. Ghi nhãn cho mẫu, điền đầy đủ thông tin (ngày thu mẫu, vị trí, ghi chú) vào bảng thông tin thu mẫu. Thu mẫu và kèm theo thu mẫu trắng. Bảo quản các ống mẫu trong thùng đá gel 4°C và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.

Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian thu mẫu

Ngày lấy mẫu Địa điểm Tọa độ Số lƣợng

15/03/2012 Đảo A6

(Hòn Mun ) 12º09’51,7”Bắc; 109º18’56,5” Đông 10

17/05/2012 Đảo A1

(Hòn Ngoại) 12°00’17,0”Bắc; 109°19’20,0” Đông 20

2.3.2 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu

Các mẫu phân chim yến đảo sau khi thu mẫu xong, được vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình vận chuyển mẫu chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như: thời gian vận chuyển, thành phần môi trường vận chuyển, thể tích ống chứa môi trường, nhiệt độ… Thời gian vận chuyển mẫu có thể kéo dài tùy thuộc vị trí các đảo thu mẫu: các đảo gần khoảng 2 - 3 giờ, các đảo ngoài khơi xa khoảng 5 - 6 giờ. Hơn nữa, mẫu được thu vào ban đêm khi đàn chim vừa đi kiếm ăn về, đến sáng hôm sau mới được vận chuyển về phòng thí nghiệm (12 giờ). Với các đảo ngoài tỉnh, thời gian vận chuyển khoảng 2 - 5 ngày. Trong khuôn khổ của đề tài, được biết nhóm nghiên cứu sẽ phải tiến hành thu mẫu ở những khu vực rất xa phòng thí nghiệm như Vũng Tàu, Phú Quốc (Kiên Giang) và Lào. Thời gian vận chuyển mẫu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình vận chuyển mẫu. Vì vậy ảnh hưởng đến kết quả kiểm nghiệm bằng phương pháp truyền thống. Vi sinh vật nhạy cảm như Salmonella, Vibrio… có thể chỉ tồn tại vài giờ sau khi thu mẫu. Mặt khác, các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh trưởng quá nhanh dẫn đến ức chế các vi khuẩn khác như Vibrio hoặc các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh trưởng quá nhanh và tiêu thụ hết chất dinh dưỡng đến pha suy vong. Môi trường vận chuyển lý tưởng là môi trường duy trì khả năng sống của vi khuẩn trong mẫu mà không thúc

đẩy vi khuẩn nhân lên. Thể tích ống chứa môi trường và thể tích môi trường trong ống ảnh hưởng đến lượng oxy trong ống để duy trì khả năng sống của vi sinh vật trong mẫu.

Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện vận chuyển với ba yếu tố: thời gian vận chuyển mẫu, thể tích ống đựng môi trường, môi trường vận chuyển mẫu.

Quy trình khảo sát điều kiện vận chuyển mẫ u

Điều kiện vận chuyển mẫu được khảo sát trên quy mô phòng thí nghiệm trên 3 loại môi trường khác nhau gồm nước muối sinh lý (NaCl 0.85%), nước muối sinh lý có bổ sung pepton 1%, và môi trường Carry - Blair. Yếu tố thể tích ống chứa mẫu cũng được khảo sát trên 2 loại dụng cụ khác nhau là eppendorf 1,5ml (chứa 1ml môi trường vận chuyển) và ống falcon 15ml (chứa 7ml môi trường vận chuyển).

Các chủng vi sinh vật được dùng để khảo sát môi trường là các vi sinh vật mục tiêu mà nhóm nghiên cứu cần kiểm định bao gồm E.coli, Salmonella spp.,

Vibrio spp. Bên cạnh đó, Lactobacillus acidophilus - vi khuẩn đường ruột có lợi cũng được bổ sung vào mẫu cần khảo sát (Bảng 2.2). Mật độ của các loại vi khuẩn được điều chỉnh để đạt độ đục 0,5 McFarland (dựa theo phương pháp xác định môi trường vận chuyển tối ưu của Gelmi và cộng sự năm 2000). Độ đục tiêu chuẩn 0,5 McFarland tương đương mật độ vi sinh vật khoảng 1,5 x 108

CFU/ml. Các ống mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4°C. Kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật mục tiêu trong các ống mẫu sau các khoảng thời gian 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 1 ngày, 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày. Thí nghiệm được lặp lại hai lần.

Bảng 2.2: Các chủng vi sinh vật sử dụng để khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu

Tên chủng Nguồn gốc Ký hiệu

E. coli ATCC 25922 (ATCC®) E1

Salmonella spp. PTN Vi sinh- Viện CNSH & MT S1

Vibrio spp. PTN Vi sinh- Viện CNSH & MT V1

2.3.3 Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật

Các vi sinh vật mục tiêu được phân lập dựa theo quy trình được xây dựng từ nhiều nguồn tham khảo khác nhau bao gồm tài liệu kiểm định vi sinh của Cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA - BAM), tài liệu “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm” của Trần Linh