Các loài chim hoang dã thường được xem là dấu hiệu để đánh giá độ đa dạng và trong lành của môi trường. Tuy nhiên, từ góc độ y tế cộng đồng, quan điểm tích cực này không hoàn toàn đúng (Jones, 2005). Ở một số nơi, chim hoang dã có thể gây ô nhiễm phân, ví dụ như các loài thủy cầm gây ra ô nhiễm phân tại các bể bơi, hồ tắm (Abulreesh và cs, 2004; Abulreesh và cs, 2005). Phân chim được xem như vector truyền bệnh - chúng có thể mang theo một lượng lớn tác nhân gây bệnh (virus, vi khuẩn, nấm và động vật nguyên sinh) phát tán trong một phạm vi rộng, các tác nhân gây bệnh này có thể được lây truyền sang người. Bản thân những con chim hoang dã này có thể đang bị bệnh hoặc khỏe mạnh nhưng là vật chủ trung gian truyền bệnh (Hubálek, 2004). Với khả năng bay lượn, di chuyển một khoảng cách xa, trong quá trình di cư hàng năm chim hoang dã có thể lây lan một số bệnh cho con người, các bệnh này có thể bùng phát trên diện rộng và trở thành dịch. Đối với các quần thể chim có mật độ đông, khả năng lây nhiễm vi sinh vật gây bệnh càng cao.
Chim Yến hàng sống bầy đàn với mật độ cao: ở các hang đáy khô có mật độ tổ 29,2 - 37,8 tổ/m2, còn các hang đáy nước có mật độ tổ 37,5 - 114,3 tổ/m2 (Phach và cs, 2002). Thêm vào đó, chim thường di chuyển xa để kiếm mồi. Với mật độ cao và khả năng di chuyển xa như vậy, khi trong đàn có một vài cá thể nhiễm bệnh, bệnh dịch có thể phát tán nhanh chóng trong quần thể; hoặc phát tán từ quần thể đảo này sang quần thể đảo khác; hoặc thậm chí có thể lây cho người. Điều này có thể làm giảm năng suất cho tổ của chim yến và đe dọa đến sức khỏe cộng đồng.
Chất thải của chim yến có thể gây ô nhiễm môi trường sống của toàn quần thể và đó cũng là nguồn lây nhiễm bệnh dịch từ cá thể bệnh sang cá thể khỏe. Đặc biệt, phân cũng có thể lẫn vào tổ yến, gây nhiễm bẩn sản phẩm tổ yến. Tuy các tổ yến thành phẩm đều qua quá trình sơ chế để đảm bảo không còn vi sinh vật gây bệnh, nhưng điều đó không đảm bảo việc loại hoàn toàn các độc tố do vi sinh vật sinh ra trước đó. Điều này có thể làm giảm chất lượng tổ yến và ảnh hưởng đến danh tiếng của yến sào Việt Nam. Ngoài ra, Công ty Yến sào Khánh Hòa còn thu chất thải của chim yến làm chất dẫn dụ chim yến. Một lượng lớn phân chim yến được sử dụng để tạo mùi cho các nhà yến mới. Nếu trong phân có vi sinh vật gây bệnh, điều này có thể vô tình làm phát tán bệnh dịch.
Từ những lý do trên, chúng tôi nghiên cứu “Bƣớc đầu khảo sát sự hiện diện của một số vi sinh vật có trong nguồn phân chim yến (Aerodramus fuciphagus) tại các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa”.
Đề tài giúp ta phần nào dự đoán được một số bệnh do vi sinh vật gây ra ở chim yến . Từ đó, đề ra phương pháp xử lý thích hợp nhất để bảo vệ và bảo tồn loài chim quý này. Đồng thời bổ sung các dữ liệu khoa học làm cơ sở cho việc quy hoạch và khai thác bền vững nguồn lợi chim yến Khánh Hòa. Đề tài này nằm trong dự án “An toàn và đa dạng sinh học chim yến” do Công ty yến sào Khánh Hòa phối hợp với Viện Công nghệ sinh học và môi trường - Trường Đại học Nha Trang thực hiện.
1.3.2.2 Mục tiêu
a) Mục tiêu của đề tài:
Nhằm khảo sát sự hiện diện của các vi sinh vật (tập trung chủ yếu vào các đối tượng Escherichia coli, Salmonella spp, Vibrio spp, nấm nen, nấm mốc) phân
lập từ phân chim yến đảo Khánh Hòa Aerodramus fuciphagus germani.
b) Nội dung nghiên cứu của dề tài:
- Khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu phân. Từ đó, tiến hành so sánh và đánh giá để chọn ra điều kiện vận chuyển tối ưu cho mẫu phân chim yến.
- Bước đầu khảo sát sự hiện diện của một số vi sinh vật (tập trung chủ yếu vào các đối tượng Escherichia coli, Salmonella spp, Vibrio spp, vi nấm) trong
nguồn phân chim yến Aerodramus fuciphagus trong khu vực các đảo yến thuộc tỉnh Khánh Hòa.
- Giám định hình thái và các đ ặc tính sinh hóa c ủa các chủng vi sinh vật phân lập được. Định danh các chủng vi sinh vật phân lập được bằng 2 phương pháp: Khóa phân loại Bergey và s ử dụng Kit API 20E.
CHƢƠNG 2: VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Đối tƣợng nghiên cứu
- Chim yến đảo hoang dã Aerodramus fuciphagus trên địa bàn tỉnh Khánh Hòa, thuộc quyền quản lý của Công ty Yến sào Khánh Hòa (SANEST).
- Thời gian nghiên cứu: từ 20/02/2012 đến ngày 02/06/2012.
2.2 Vật liệu, dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
- Các loại hóa chất và môi trường nuôi cấy vi sinh của hãng Merk (Đức): BGBL, RV, Tryptone Water, MR - P V, SCA, Phenol Red Borth và các loại đường lactose, sucrose, mannitol, thanh thử oxidase ...
- Các loại môi trường nuôi cấy vi sinh của hãng Himedia (Ấn Độ): Cary Blair, APW, BPW, EMB, TCBS, XLD, KIA, SDA…
- Sử dụng bộ Kit API 20E c ủa công ty BioMérieux (Pháp) và các thiết bị đi kèm như máy đo độ đục Densimat (BioMérieux - Pháp), máy định danh vi khuẩn mini API (BioMérieux - Pháp).
- Một số dụng cụ và thiết bị cần thiết trong phòng thí nghiệm: Hộp lồng, que cấy, đèn cồn, ống nghiệm, giá ống nghiệm, tủ cấy an toàn sinh học, nồi hấp, tủ sấy, tủ ấm, tủ lạnh, máy vortex, …
2.3 Phƣơng pháp nghiên cứu 2.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu 2.3.1 Phƣơng pháp thu mẫu
Chim yến đảo Khánh Hòa Aerodramus fuciphagus có kích thước rất nhỏ (chiều dài cơ thể: 12cm, trọng lượng cơ thể: 14,58 g) (Phach và cs, 2002). Nếu sử dụng phương pháp ngoáy lỗ niệu (như đối với các đối với các loài động vật lông vũ khác) sẽ làm tổn thương chim yến. Để khắc phục khó khăn này, chúng tôi tiến hành thu mẫu phân sau khi chim thải ra môi trường. Chim yến trên đảo được các cán bộ kỹ thuật bắt và cho vào lồng giấy đã được chuẩn bị sẵn, lồng chim có kích thước (30 x 30 x 30cm), đáy lồng có lót giấy đã được sấy khử trùng. Chim ở trong lồng khoảng 30 phút, thì hầu hết đều thải phân, tiến hành thu mẫu phân theo quy trình
của Tổ chức Thú y Thế giới (OIE, 2008). Sau khi thu mẫu xong, thả chim về với tự nhiên.
Hình 2.1: Vị trí các đảo đã tiến hành thu mẫu phân chim yến
: nơi tiến hành lấy mẫu phân chim yến
Quy trình thu mẫu(theo quy trình của OIE, 2008)
Mẫu được thu ở hai vị trí. Vào trung tuần tháng 3, tiến hành thu mẫu lần đầu tại đảo A6 - Hòn Mun (12º09’51,7”Bắc; 109º18’56,5” Đông) cách bờ khoảng 10km với số lượng 10 mẫu. Mẫu được thu lần hai vào giữa tháng 5 tại đảo A1 - Hòn Ngoại (12°00’17,0”Bắc; 109°19’20,0” Đông) cách bờ khoảng 10 km với số lượng 20 mẫu. Hai đảo này cách nhau khoảng 18 km (theo đường chim bay) (Hình 2.1 và Bảng 2.1).
Dùng tăm bông vô trùng đã thấm môi trường vận chuyển quệt vào bãi phân mà chim yến vừa thải ra, thấy phân bám vào xung quanh đầu tăm bông là được. Thời gian tiếp xúc giữa mẫu phân và tăm bông khoảng 30 giây. Đặt tăm bông vừa
Đảo A6 (Hòn Mun)
Đảo A1 (Hòn Ngoại)
thu mẫu vào trong ống chứa môi trường. Ghi nhãn cho mẫu, điền đầy đủ thông tin (ngày thu mẫu, vị trí, ghi chú) vào bảng thông tin thu mẫu. Thu mẫu và kèm theo thu mẫu trắng. Bảo quản các ống mẫu trong thùng đá gel 4°C và vận chuyển nhanh về phòng thí nghiệm.
Bảng 2.1: Địa điểm và thời gian thu mẫu
Ngày lấy mẫu Địa điểm Tọa độ Số lƣợng
15/03/2012 Đảo A6
(Hòn Mun ) 12º09’51,7”Bắc; 109º18’56,5” Đông 10
17/05/2012 Đảo A1
(Hòn Ngoại) 12°00’17,0”Bắc; 109°19’20,0” Đông 20
2.3.2 Phƣơng pháp khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu
Các mẫu phân chim yến đảo sau khi thu mẫu xong, được vận chuyển về phòng thí nghiệm. Tuy nhiên, khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình vận chuyển mẫu chịu ảnh hưởng của nhiều yếu tố như: thời gian vận chuyển, thành phần môi trường vận chuyển, thể tích ống chứa môi trường, nhiệt độ… Thời gian vận chuyển mẫu có thể kéo dài tùy thuộc vị trí các đảo thu mẫu: các đảo gần khoảng 2 - 3 giờ, các đảo ngoài khơi xa khoảng 5 - 6 giờ. Hơn nữa, mẫu được thu vào ban đêm khi đàn chim vừa đi kiếm ăn về, đến sáng hôm sau mới được vận chuyển về phòng thí nghiệm (12 giờ). Với các đảo ngoài tỉnh, thời gian vận chuyển khoảng 2 - 5 ngày. Trong khuôn khổ của đề tài, được biết nhóm nghiên cứu sẽ phải tiến hành thu mẫu ở những khu vực rất xa phòng thí nghiệm như Vũng Tàu, Phú Quốc (Kiên Giang) và Lào. Thời gian vận chuyển mẫu là một trong những yếu tố quan trọng ảnh hưởng đến khả năng sống của vi sinh vật trong quá trình vận chuyển mẫu. Vì vậy ảnh hưởng đến kết quả kiểm nghiệm bằng phương pháp truyền thống. Vi sinh vật nhạy cảm như Salmonella, Vibrio… có thể chỉ tồn tại vài giờ sau khi thu mẫu. Mặt khác, các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh trưởng quá nhanh dẫn đến ức chế các vi khuẩn khác như Vibrio hoặc các vi khuẩn Enterobacteriaceae sinh trưởng quá nhanh và tiêu thụ hết chất dinh dưỡng đến pha suy vong. Môi trường vận chuyển lý tưởng là môi trường duy trì khả năng sống của vi khuẩn trong mẫu mà không thúc
đẩy vi khuẩn nhân lên. Thể tích ống chứa môi trường và thể tích môi trường trong ống ảnh hưởng đến lượng oxy trong ống để duy trì khả năng sống của vi sinh vật trong mẫu.
Từ những lý do trên, chúng tôi tiến hành khảo sát điều kiện vận chuyển với ba yếu tố: thời gian vận chuyển mẫu, thể tích ống đựng môi trường, môi trường vận chuyển mẫu.
Quy trình khảo sát điều kiện vận chuyển mẫ u
Điều kiện vận chuyển mẫu được khảo sát trên quy mô phòng thí nghiệm trên 3 loại môi trường khác nhau gồm nước muối sinh lý (NaCl 0.85%), nước muối sinh lý có bổ sung pepton 1%, và môi trường Carry - Blair. Yếu tố thể tích ống chứa mẫu cũng được khảo sát trên 2 loại dụng cụ khác nhau là eppendorf 1,5ml (chứa 1ml môi trường vận chuyển) và ống falcon 15ml (chứa 7ml môi trường vận chuyển).
Các chủng vi sinh vật được dùng để khảo sát môi trường là các vi sinh vật mục tiêu mà nhóm nghiên cứu cần kiểm định bao gồm E.coli, Salmonella spp.,
Vibrio spp. Bên cạnh đó, Lactobacillus acidophilus - vi khuẩn đường ruột có lợi cũng được bổ sung vào mẫu cần khảo sát (Bảng 2.2). Mật độ của các loại vi khuẩn được điều chỉnh để đạt độ đục 0,5 McFarland (dựa theo phương pháp xác định môi trường vận chuyển tối ưu của Gelmi và cộng sự năm 2000). Độ đục tiêu chuẩn 0,5 McFarland tương đương mật độ vi sinh vật khoảng 1,5 x 108
CFU/ml. Các ống mẫu được bảo quản ở nhiệt độ 4°C. Kiểm tra sự hiện diện của các vi sinh vật mục tiêu trong các ống mẫu sau các khoảng thời gian 0 giờ, 6 giờ, 12 giờ, 1 ngày, 5 ngày, 10 ngày, 15 ngày. Thí nghiệm được lặp lại hai lần.
Bảng 2.2: Các chủng vi sinh vật sử dụng để khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu
Tên chủng Nguồn gốc Ký hiệu
E. coli ATCC 25922 (ATCC®) E1
Salmonella spp. PTN Vi sinh- Viện CNSH & MT S1
Vibrio spp. PTN Vi sinh- Viện CNSH & MT V1
2.3.3 Phƣơng pháp phân lập vi sinh vật
Các vi sinh vật mục tiêu được phân lập dựa theo quy trình được xây dựng từ nhiều nguồn tham khảo khác nhau bao gồm tài liệu kiểm định vi sinh của Cơ quan Quản lý thực phẩm và dược phẩm Hoa Kỳ (FDA - BAM), tài liệu “Phương pháp phân tích vi sinh vật trong nước, thực phẩm và mỹ phẩm” của Trần Linh Thước (2002) và “Sổ tay kiểm nghiệm vi sinh thực phẩm thủy sản của Bộ Thủy sản” (Nguyễn Đức Hùng và cs, 2004).
Mẫu sau khi đem về phòng thí nghiệm, được pha loãng hai lần trong dung dịch SPW vô trùng, sau đó dịch pha loãng được cấy vào các môi trường canh thang tăng sinh chọn lọc và tăng sinh không chọn lọc tùy theo từng chỉ tiêu:
Đối với chỉ tiêu E.coli, mẫu được tăng sinh chọn lọc trong các ống nghiệm
chứa môi trường canh thang BGBL có ống durham. Các ống nghiệm được ủ ở 44°C trong 24 giờ. Chọn các mẫu dương tính (đục, sinh hơi) cấy ria sang môi trường chọn lọc EMB. Các khuẩn lạc tím đen có ánh kim được nhận định là E. coli. Làm
thuần các khuẩn lạc trên cùng môi trường chọn lọc sau đó đem đi kiểm tra các test sinh hóa.
Đối với chỉ tiêu Samonela, mẫu được tăng sinh trong dung dịch BPW, ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ. Sau đó, mẫu tiếp tục được tăng sinh chọn lọc ở môi trường RV, ủ ở 40°C trong 18 -24 giờ. Chọn các mẫu dương tính (đổi màu: trắng, đục) cấy ria sang môi trường chọn lọc XLD. Các khuẩn lạc trắng hồng, trong suốt, có tâm đen được nhận định là Salmonella. Làm thuần các khuẩn lạc trên cùng môi trường chọn lọc sau đó đem đi kiểm tra các test sinh hóa.
Đối với chỉ tiêu Vibrio, mẫu được tăng sinh chọn lọc trong dung dịch APW, ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ. Sau đó, mẫu được cấy trên môi trường tăng sinh chọn lọc TCBS, ủ ở 37°C trong 18 -22 giờ. Chọn các khuẩn lạc vàng hoặc xanh lục, to, có đường kính khoảng 2 - 3 mm hoặc 3 4 mm làm thuần các khuẩn lạc trên cùng môi trường chọn lọc sau đó đem đi kiểm tra các test sinh hóa.
Đối với chỉ tiêu vi nấm, mẫu được cấy trang trên môi trường SDA có bổ sung Chloramphenicol sao cho đạt nồng độ 0,05 g/l, ủ ở nhiệt độ phòng trong 4 -5 ngày. Quan sát các khuẩn lạc nấm mốc và nấm men (nếu có). Sau đó, đem soi kính hiển vi để quan sát hình thái.
Quy trình phân lập được thể hiện ở Hình 2.2
Hình 2.2: Sơ đồ quá trình phân lập vi sinh vật
Pha loãng Mẫu Chỉ tiêu nấm men nấm mốc tổng số Chỉ tiêu Vibrio spp. Chỉ tiêu Salmonella spp. Chỉ tiêu E.coli
Môi trường SDA ( 25°C, 4-5 ngày) Môi trường APW
( 37°C, 24 giờ) Môi trường BPW ( 37°C, 24 giờ) Môi trường BGBL ( 44°C, 24 giờ)
Giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh hóa
Định danh Quan sát hình thái Môi trường TCBS ( 37°C, 24 giờ) Môi trường RV ( 40°C, 24 giờ) Môi trường EMB
( 37°C, 24 giờ)
Môi trường XLD ( 37°C, 24 giờ)
2.3.4 Phƣơng pháp giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh hóa
Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập làm thuần được đem đi kiểm tra một số đặc tính bao gồm : Gram, tính di động, các phản ứng sinh hóa (khả năng lên men các loại đường: gồm lactose, glucose, sucrose, nhóm test IMViC (Indol, MR, VP, Citrate), sinh H2S, sinh hơi, catalase, urease, oxidase,… Các phản ứng sinh hóa được thực hiện bằng các môi trường thương mại hoặc tự pha theo thành phần để định danh theo phương pháp truyền thống (khóa phân loại vi sinh vật của Bergey). Sau đó, đặc biệt là đối với các chủng nghi ngờ có độc tính cao (Salmonella,
Vibrio… ), hệ thống định danh API 20E được sử dụng để định danh khẳng định vi
sinh vật. Ngoài ra, dựa vào các đặc điểm của vi sinh vật xác định bằng bộ kit API 20E kết hợp với một số đặc điểm khác (không có trong kit API 20E) dùng để xác định danh vi sinh vật bằng phần mềm ABIS.
2.3.4.1 Phƣơng pháp giám định hình thái và tính bắt màu
Để kiểm tra hình thái và tính bắt màu của các chủng vi khuẩn vừa phân lập được, ta sử dụng 2 phương pháp: kiểm tra nhanh vi khuẩn Gram âm bằng KOH và nhuộm Gram.
Phương pháp nhuộm Gram
Năm 1884, Hans Christian Joachim Gram - nhà khoa học người Đan Mạch đã sáng chế ra phương pháp nhuộm vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập được, tiến hành nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần . Vi khuẩn E. coli, Salmonella spp., Vibrio spp. đều là những trực khuẩn Gram âm
bắt màu đỏ (Quinn và cs, 1994).
Phương pháp kiểm tra nhanh Gram bằng KOH
Nhỏ 1 giọt KOH 3% lên phiến kính sạch, dùng que cấy lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cho vào vị trí có giọt KOH 3%. Dùng que cấy làm tan khuẩn lạc đưa que cấy lên, nếu có sợi tơ keo nhầy kéo theo là vi khuẩn Gram âm, nếu không có sợi tơ