Pha loãng Mẫu Chỉ tiêu nấm men nấm mốc tổng số Chỉ tiêu Vibrio spp. Chỉ tiêu Salmonella spp. Chỉ tiêu E.coli
Môi trường SDA ( 25°C, 4-5 ngày) Môi trường APW
( 37°C, 24 giờ) Môi trường BPW ( 37°C, 24 giờ) Môi trường BGBL ( 44°C, 24 giờ)
Giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh hóa
Định danh Quan sát hình thái Mơi trường TCBS ( 37°C, 24 giờ) Mơi trường RV ( 40°C, 24 giờ) Môi trường EMB
( 37°C, 24 giờ)
Môi trường XLD ( 37°C, 24 giờ)
2.3.4 Phƣơng pháp giám định hình thái và kiểm tra đặc tính sinh hóa
Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập làm thuần được đem đi kiểm tra một số đặc tính bao gồm : Gram, tính di động, các phản ứng sinh hóa (khả năng lên men các loại đường: gồm lactose, glucose, sucrose, nhóm test IMViC (Indol, MR, VP, Citrate), sinh H2S, sinh hơi, catalase, urease, oxidase,… Các phản ứng sinh hóa được thực hiện bằng các môi trường thương mại hoặc tự pha theo thành phần để định danh theo phương pháp truyền thống (khóa phân loại vi sinh vật của Bergey). Sau đó, đặc biệt là đối với các chủng nghi ngờ có độc tính cao (Salmonella,
Vibrio… ), hệ thống định danh API 20E được sử dụng để định danh khẳng định vi
sinh vật. Ngoài ra, dựa vào các đặc điểm của vi sinh vật xác định bằng bộ kit API 20E kết hợp với một số đặc điểm khác (khơng có trong kit API 20E) dùng để xác định danh vi sinh vật bằng phần mềm ABIS.
2.3.4.1 Phƣơng pháp giám định hình thái và tính bắt màu
Để kiểm tra hình thái và tính bắt màu của các chủng vi khuẩn vừa phân lập được, ta sử dụng 2 phương pháp: kiểm tra nhanh vi khuẩn Gram âm bằng KOH và nhuộm Gram.
Phương pháp nhuộm Gram
Năm 1884, Hans Christian Joachim Gram - nhà khoa học người Đan Mạch đã sáng chế ra phương pháp nhuộm vi khuẩn. Các chủng vi khuẩn sau khi phân lập được, tiến hành nhuộm Gram và soi dưới kính hiển vi với độ phóng đại 1000 lần . Vi khuẩn E. coli, Salmonella spp., Vibrio spp. đều là những trực khuẩn Gram âm
bắt màu đỏ (Quinn và cs, 1994).
Phương pháp kiểm tra nhanh Gram bằng KOH
Nhỏ 1 giọt KOH 3% lên phiến kính sạch, dùng que cấy lấy khuẩn lạc cần kiểm tra cho vào vị trí có giọt KOH 3%. Dùng que cấy làm tan khuẩn lạc đưa que cấy lên, nếu có sợi tơ keo nhầy kéo theo là vi khuẩn Gram âm, nếu khơng có sợi tơ kéo theo là vi khuẩn Gram dương (Quinn và cs, 1994)
2.3.4.2 Phƣơng pháp kiểm tra đặc tính sinh hóa
Các chủng vi khuẩn sau khi giám định hình thái, tiến hành kiểm tra một số test sinh hóa cơ bản sau:
Kiểm tra tính di động
Dùng que cấy thẳng vơ trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấy một đường đâm sâu vào giữa ống chứa môi trường thạch mềm có bổ sung Triphenyltetrazolium chloride (TTC) nồng độ 0,05 g/l đến độ sâu khoảng 2 cm. Các ống được ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ, sau đó ủ tiếp ở 21 - 25°C đến 5 ngày. Đọc kết quả: nếu vi khuẩn tạo thành một vùng đục màu đỏ lan tỏa vào môi trường hai bên đường cấy thì kết quả dương tính, vi khuẩn có tính di động; nếu vi khuẩn chỉ tạo thành một đường màu đỏ dọc theo đường cấy thì kết quả âm tính, vi khuẩn khơng di động; ống đối chứng khơng có vi sinh vật tăng trưởng, môi trường trong (Trần Linh Thước, 2009)
Kiểm tra khả năng lên men đường
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấy vào các ống môi trường lỏng Phenol Red Broth Base có chứa các loại đường khác nhau (lactose, sucrose, mannitol, sorbitol). Sau khi cấy ủ các ống môi trường ở 37°C trong 18 - 20 giờ. Sau đó, tiến hành đọc kết quả: phản ứng dương tính khi mơi trường màu đỏ chuyển sang vàng, phản ứng âm tính khi mơi trường có màu đỏ (Trần Linh Thước, 2009).
Kiểm tra sinh hóa trên mơi trường KIA
Dùng que cấy lấy khuẩn lạc cấy lên môi trường KIA: ria trên phần thạch nghiêng và đâm sâu xuống đáy ống nghiệm phần thạch đứng, ủ ở tủ ấm 37ºC, thời gian 18-24 giờ thì đọc kết quả. Môi trường KIA cho phép xác định được 4 tính chất: lên men đường glucose, lên men đường lactose, sinh hơi và sinh H2S (khả năng khử sulfate). Vi sinh vật có khả năng lên men đường glucose làm chuyển màu đỏ sang vàng trên phần thạch nghiêng. Phần thạch sâu đổi màu từ đỏ sang vàng khi vi sinh vật có khả năng lên men đường lactose. Các vi sinh vật có khả năng sinh hơi mạnh
sẽ làm thạch bị nứt hoặc đẩy thạch khỏi đáy ống nghiệm, các chủng sinh hơi yếu làm môi trường ống thạch xuất hiện bọt khí. Nếu ống nghiệm xuất hiện màu đen nghĩa là vi sinh vật mục tiêu có khả năng sinh H2S (Lassen, 1997).
Kiểm tra khả năng sinh Indol
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấ y vào môi trường lỏng Tryptone, ủ ở 37°C trong 24 - 48 giờ. Nhỏ 5 giọt thuốc thử Kovac (p-Dimethylaminobenzaldehyde p-DMABA) vào ống dịch nuôi cấy, để yên vài phút rồi đọc kết quả: nếu có sự xuất hiện của lớp màu đỏ trên bề mặt mơi trường thì kết quả dương tính, vi khuẩn có khả năng sinh indol; nếu có sự xuất hiện của lớp màu vàng trên bề mặt mơi trường thì kết quả âm tính, vi khuẩn khơng có khả năng sinh indol. Test sinh hóa này thử nghiệm khả năng sinh enzyme tryptophanase oxy hóa tryptophan thành sản phẩm có chứa gốc indol (Trần Linh Thước, 2009).
Phép thử Methyl Red (MR)
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấy vào môi trường lỏng MR - VP ủ ở 37°C trong 18 - 24 giờ. Thêm vài giọt thuốc thử Methyl red 0,02% vào trong ống dịch nuôi cấy, đọc kết quả ngay: nếu mơi trường có màu đỏ sau khi bổ sung thuốc thử thì phép thử dương tính; nếu mơi trường có màu vàng sau khi bổ sung thuốc thử thì phép thử âm tính; nếu mơi trường có màu cam sau khi bổ sung thuốc thử, cần tiếp tục ủ ống mơi tường có giống trong 4 ngày và thực hiện lại phép thử. Phép thử MR nhằm phân biệt vi sinh vật dựa trên sự khác biệt về khả năng tạo ra và duy trì các sản phẩm biến dưỡng có tính acid bền tro ng mơi trường trong q trình lên men glucose (Trần Linh Thước, 2009) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phép thử Voges - Proskauer (VP)
Dùng que cấy vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra, cấy vào môi trường lỏng MR-VP, ủ ở 37°C trong 24 - 48 giờ hoặc đến 10 ngày khi cần thiết. Sau thời gian ủ, bổ sung thuốc thử trực tiếp vào ống môi trường. Thuốc thử có hai thành phần, nhỏ 6 giọt dung dịch A (α-naphthol 5% trong cồn tuyệt đối), sau đó nhỏ 2 giọt dung dịch B (KOH 40%). Đọc kết quả sau 20 phút hoặc chậm nhất là 4 giờ: nếu có màu đỏ trên bề mặt mơi trường sau khi bổ sung thuốc thử thì phép thử
dương tính; nếu khơng đổi màu sau khi bổ sung thuốc thử thì phép thử âm tính. Phép thử VP có thể giúp phân biệt các lồi trong Enterobacteriacease dựa trên sự oxi hóa acetoin từ 2,3-butanediol thành diacetyl (Trần Linh Thước, 2009).
Kiểm tra khả năng biến dưỡng citrate
Dùng que cấy vơ trùng vơ trùng lấy một ít khuẩn lạc chủng thuần cần kiểm tra, cấy ria trên bề mặt môi trường SCA. Sau khi ủ ở 35°C trong 24 - 48 giờ, tiến hành đọc kết quả: phép thử dương tính khi xuất hiện khuẩn lạc và môi trường chuyển sang màu xanh dương, âm tính khi khơng xó khuẩn lạc và mơi trường giữ nguyên màu xanh lục. Test sinh hóa này thử nghiệm khả năng sinh biến dưỡng citrate của vi sinh vật làm tăng pH của môi trường (Trần Linh Thước, 2009).
Kiểm tra Catalase
Dùng que cấy thẳng vô trùng lấy khuẩn lạc của chủng thuần cần kiểm tra đặt lên lam kính sạch. Nhỏ một giọt H2O2 30% lên khẩn lạc trên lam kính. Quan sát nếu có hiện tượng sủi bọt khí thì catalase dương tính, ngược lại nếu khơng có sủi bọt khí thì catalase âm tính. Test sinh hóa này thử nghiệm khả năng sinh emzyme catalase thủy phân H2O2 thành H2Ovà O2, ngăn cản sự tích tụ H2O2 trong tế bào. Các vi khuẩn trong hai họ Enterobacteriacease và Vibrionaceae đều dương tính với phép thử catalase. (Trần Linh Thước, 2009).
Kiểm tra Oxidase
Sử dụng thanh thử oxidase thương mại là thanh giấy có tẩm tetramethyl-p- phenylenediamine dihydrochloride. Dùng que cấy vịng vơ trùng thu lấy sinh khối vi sinh vật, dàn đều lên vị trí có thuốc thử trên thanh giấy. Quan sát và ghi nhận sự xuất hiện màu xanh dương trong vài phút. Phản ứng oxidase dương tính khi xuất hiện màu xanh dương, nếu không xuất hiện màu xanh dương thì phản ứng âm tính. Test sinh hóa này thử nghiệm sự hiện diện của hệ emzyme oxidase ở vi sinh vật (quan trọng nhất là cytochrome oxidase). Phép thử này giúp phân biệt các vi khuẩn trong hai họ Enterobacteriacease (oxidase âm tính) và Vibrionaceae (oxidase dương tính) (Trần Linh Thước, 2009).
Kiểm tra Urease
Dùng que cấy vơ trùng vơ trùng lấy một ít khuẩn lạc chủng thuần cần kiểm tra, cấy vào mơi trường có chứa Urea và phenol red, ủ ở 37°C trong 48 giờ. Quan sát và ghi nhận sự chuyển màu vào thời điểm sau 8, 12, 24, 48 giờ. Tiến hành đọc kết quả: phép thử dương tính khi mơi trường chuyển từ màu vàng cam sang màu đỏ tím, phép thử âm tính khi mơi trường có màu vàng cam khơng đổi. Test sinh hóa này thử nghiệm khả năng sinh enzyme urease xúc tác thủy phân urea giải phóng NH3 và CO2 (Trần Linh Thước, 2009).
2.3.5 Phƣơng pháp định danh
2.3.5.1 Phƣơng pháp định danh theo khóa phân loại Bergey
“Hệ thống phân loại vi sinh vật Bergey” của David Hendricks Bergey được xuất bản lần đầu tiên vào năm 1923, được sử dụng để phân loại vi sinh vật dựa trên các đặc tính, cấu trúc và chức năng của chúng bằng cách sắp xếp chúng thành bộ, họ cụ thể. Những lần tái bản sau có chỉnh sửa và bổ sung thêm một số vi sinh vật mới phát hiện. Các đặc điểm dùng để định danh vi sinh vật hiện nay của WHO, FDA, FAO đều dựa trên hệ thống phân loại Bergey.
Dựa vào các đặc tính hình thái và sinh hóa đã kiểm tra, tơi sử dụng “Hệ thống phân loại vi sinh vật Bergey” phiên bản năm 2005 để định danh các chủng vi sinh vật vừa phân lập được (Krieg và Holt, 2005), (Phụ lục 1).
2.3.5.2 Phƣơng pháp sử dụng Kit sinh hóa API 20E để định danh
Các đặc điểm về hình thái, sinh hố của vi khuẩn được xác định bằng cách kiểm tra phép thử cơ bản và sử dụng Kit API 20E. API 20E là một hệ thống định danh chuẩn cho các vi khuẩn Gram âm thuộc họ Enterobacteriaceae, được sản xuất lần đầu tiên vào năm 1986. Hệ thống định danh gồm thanh API 20E có 21 test sinh hóa thu nhỏ (lên men các loại đường glucose, sorbitol, mannitol, sucrose, inositol, rhamnose, melibiose, amygdalin, arabinose; thủy phân urea, gelatin; biến dưỡng citrate; sinh H2S, sinh indol, phép thử VP, ONPG, ADH, LDC, ODC, TDA, khử nitrate thành nitrite) và một cơ sở dữ liệu. Cơ sở dữ liệu đã mở rộng từ 87 loài (năm
1977) lên 102 loài (năm 2003). Cơ sở dữ liệu hiện tại đang dược sử dụng là phiên bản 4.0. Thanh API 20 E bao gồm 20 giếng nhỏ có chứa các cơ chất dạng khơ.
Kit API 20E của cơng ty BioMérieux có thể định danh vi sinh vật ở mức độ loài mà không phải mất nhiều thời gian và công sức trong việc tìm kiếm phương pháp, chuẩn bị dụng cụ, pha hóa chất. Kit API 20E rất phù hợp khi định danh số lượng mẫu lớn. Hơn nữa, Kit API 20E là cơng cụ định danh vi khuẩn có uy tín trên thị trường.
Tuy nhiên Kit API 20E không định danh hết tất cả các vi sinh vật mà chỉ cho phép định danh được một số vi khuẩn Gram âm khơng khó tính, chủ yếu tập trung vào họ Enterobacteriaceae. Một số vi khuẩn Gram âm khó tính, u cầu cao về dinh dưỡng và địi hỏi phải có cách xử lý thích hợp nên khơng thể định danh được trong khuôn khổ Kit API 20E. Thêm vào đó, giá thành khá cao: một thanh API hiện nay trên thị trường có giá 11 USD/thanh. Như vậy tăng thêm chi phí cho q trình nghiên cứu.
Quy trình thực hiện (theo hướng dẫn của nhà sản xuất)
Dùng que lấy một ít khuẩn lạc cho vào ống chứa dung dịch nước muối sinh lý vô trùng (0.85% NaCl), vortex. Sử dụng máy đo độ đục Desimat, điều chỉnh sao cho đạt độ đục 0,5 McFarland (tương đương khoảng 1,5 x 108
CFU/ml). Hút dịch vi khuẩn cho vào các giếng nhỏ có chứa cơ chất. Riêng các giếng CIT, VP, GEL cho đầy dịch, cịn các ơ ADH, LDC, ODC, H2S, URE cho thêm dầu khoáng, ủ ở 36°C trong thời gian 18 - 24 giờ. Tiến hành đọc kết quả bằng mắt tra theo bảng đọc kết quả (Phụ lục 2). Tra kết quả vào máy dịnh danh vi khuẩn mini API (BioMérieux).
2.3.5.3 Phƣơng pháp sử dụng phần mềm ABIS để định danh
ABIS (Advanced Bacterial Identification Software - phần mềm định danh vi khuẩn nâng cao) được tiến hành xây dựng vào năm 2003. Đây là một phần của dự án xây dựng và phát triển cơ sở dữ liệu về vi khuẩn online. Dự án này ban đầu nhằm mục đích để định danh các vi sinh vật thuộc họ Enterobacteriaceae dựa trên các cơ sở dữ liệu về đặc điểm sinh hóa, hình thái, đặc điểm phát triển, sinh thái, và bệnh học. Phiên bản 4 của ABIS được nâng cấp và có thêm một số nhóm vi khuẩn Gram dương gồm Bacillus, Streptococcus và Staphylococcus. Phiên bản 5 của phần mềm này có thêm các nhóm cầu khuẩn Gram âm, trực khuẩn Gram dương. Cũng trong cùng dự án, các phần mềm khác cũng được phát triển bao gồm ATI (AntibioGram analyser - phân tích kháng sinh đồ) và Uncle Salm (Salmonella isolation and identification scheme - chiến lược định phân lập và định danh
Salmonella).
Trong nghiên cứu này, chúng tôi sử dụng ABIS phiên bản 7. Để tiến hành định danh trên phần mềm ABIS, các dữ liệu về các đặc điểm thu thập trong suốt q trình thí nghiệm (từ kit API-20 và các kiểm nghiệm khác) được nhập vào hệ thống ABIS sau đó đọc kết quả và so sánh với kết quả định danh bằng khóa phân loại Bergey và API 20E. Cơ sở dư liệu này gồm 47 đặc điểm khác nhau để định danh họ Enterobacteriaceae và 45 đặc điểm khác nhau để định danh họ Vibrionaceae.
3 CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu phân chim yến 3.1 Khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu phân chim yến
Kết quả khảo sát cho thấy ống falcon 15ml chứa môi trường Cary - Blair là điều kiện vận chuyển tối ưu nhất. Với điều kiện vận chuyển này, các vi sinh vật mục tiêu vẫn còn hiện diện sau 15 ngày (kể từ ngày thu mẫu). Ta chọn điều kiện tối ưu này để tiến hành chuẩn bị cho quá trình vận chuyển mẫu (Bảng 3.1) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Bảng 3.1: Kết quả khảo sát điều kiện vận chuyển mẫu
Điều kiện khảo sát 1h 6h 12h 1 ngày 2 ngày 5 ngày 10 ngày 15 ngày
Eppendor f 1,5 ml 0,85% NaCl E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (-) V1 (-) Eppendor f 1,5 ml 0,85% NaCl + 1% pe ptone E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (-) S1 (-) V1 (-) Eppendor f 1,5 ml Car y – Bl air E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (-) V1 (-) Falcon 15ml 0,85% NaCl E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (-) Falcon 15ml 0,85% NaCl + 1% pe ptone E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (-) V1 (+) Falcon 15ml Car y – Bl air E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) E1 (+) S1 (+) V1 (+) Ghi chú:
E1: chủng E. coli ATCC 25922 S1: chủng Salmonella spp. V1: chủng Vibrio spp.
Kết quả cịn cho thấy mơi trường Cary - Blair là môi trường vận chuyển tốt nhất trong ba môi trường được khảo sát. Ở cả hai thể tích eppendorf 1,5 ml và ống falcon 15 ml, mơi trường Cary - Blair duy trì sự hiện diện của các vi sinh vật mục
tiêu với thời gian dài hơn so với hai mơi trường cịn lại. Mơi trường Cary - Blair có Sodium thioglycollate làm giảm thế oxy hóa - khử trong môi trường giúp kéo dài thời gian sống của vi sinh vật. Đồng thời, môi trường khơng chứa chất dinh dưỡng, có chứa đệm phosphate giúp ức chế phần nào sự sinh sản và hoạt động mạnh mẽ của Escherichia coli and Klebsiella aerogenes. pH cao giúp Vibrio trong mẫu tồn