Nguyên liệu sau khi qua các khâu xử lý: sấy khô ở 500C– xay nhỏ qua rây 0.5mm – tách béo với n-hexan (100g- 300ml, 3lần, 6h) – chiết (2g bột rau + 250ml dung môi) để khảo sát các điều kiện– lọc các qua giấy lọc có đường kính lỗ lọc 0.05mm (lọc thơ), 0.45µm [23] (lọc tinh), sau đó chúng tơi tiến hành định tính và định lượng bằng HPLC để xác định sự có mặt cũng như hiệu quả thu hồi asiaticoside trong rau má khi chiết bằng các loại dung môi khác nhau.
3.2.1. Nghiên cứu ảnh hưởng của dung mơi đến q trình chiếtasiaticoside trong rau má asiaticoside trong rau má
Dung mơi là một yếu tố có vai trị quyết định trong q trình chiết. Mỗi dung mơi có khả năng hịa tan các hợp chất khác nhau ở các mức độ khác nhau nên ảnh hưởng rất lớn đến hiệu suất thu hồi các hợp chất đó. Do vậy việc khảo sát để lựa chọn dung môi là cần thiết.
Dung mơi ít phân cực thì dễ hịa tan các chất khơng phân cực và khó hịa tan các chất có nhiều nhóm phân cực. Ngược lại, dung mơi phân cực mạnh thì dễ hịa tan các chất có nhiều nhóm phân cực và khó hịa tan các chất ít phân cực.
Trên những tiêu chí đó cùng với tính chất của dung mơi cũng như của hoạt chất chúng tôi tiến hành khảo sát một số loại dung môi theo các công thức CT1, CT2, CT3 trình bày ở mục 2.2.2 ở nhiệt độ sơi của dung môi với thời gian chiết 6h.
Sau đây là các phổ sắc kí của asiaticoside khi khảo sát với các dung mơi với mẫu asiaticoside chuẩn (nồng độ 2mg/ml), được trình bày ở các hình 3.1- 3.3.
Hình 3.2. Phổ sắc kí của asiaticoside ứng với cơng thức CT1
Hình 3.3. Phổ sắc kí của asiaticoside ứng với cơng thức CT2
Hình 3.4. Phổ sắc kí của asiaticoside ứng cơng thức CT3
Qua phân tích HPLC cho thấy mẫu chuẩn asiaticoside hình 3.1 có 1 peak ở thời gian lưu 2.345 phút. Phổ sắc ký của các mẫu khảo sát dung mơi
được trình bày ở các hình 3.7-3.11 đều có mặt của 1 peak có thời gian lưu trong khoảng từ 2,320 -2.347 phút, tương đương với thời gian lưu của peak asiaticoside chuẩn với hàm lượng khá cao, chứng tỏ trong thành phần của dịch chiết rau má có mặt hoạt chất asiaticoside. Như vậy các dung mơi được chọn đều có khả năng hịa tan asiaticoside nhưng với mỗi loại dung mơi khác thì hàm lượng asiaticoside sẽ khác nhau.
Kết quả nghiên cứu ảnh hưởng của các loại dung môi đến hiệu suất thu hồi asiaticoside trong rau má được thể hiện ở đồ thị sau.
Đồ thị 1. Hàm lượng asiaticoside khi khảo sát dung môi
Theo đồ thị 1, chúng tôi thấy hàm lượng asiaticoside tách ra khi dùng methanol để chiết là lớn nhất với 16.20 mg/g, gấp khoảng 2 lần so với dung môi etyl acetat 8mg/g, và gấp khoảng 1.5 lần nếu dùng ethanol 10.67mg/g. Kết quả đó chứng tỏ methanol và ethanol tách chiết tốt hơn etyl acetat. Kết quả methanol là dung môi chiết tốt nhất để chiết asiaticosside phù hợp với kết quả nghiên cứu với Verma [18], tuy nhiên hàm lượng asiaticoside tách ra mà chúng tôi đã nghiên cứu cao hơn so với kết quả Verma khoảng 3lần. Điều này chỉ có thể giải thích do sự khác nhau của các phương pháp chiết [22] hoặc do sự khác nhau về nguồn nguyên liệu nên tác động của từng vùng nhiệt độ các nhau có thể làm cho hàm lượng asiaticosside tích lũy trong rau cũng khác nhau [13].
Ta biết asiaticoside là hợp chất có tính phân cực do trong cấu trúc có các phân tử glycoside chứa nhiều các gốc OH. Trong khi đó ethanol và
methanol là các dung mơi có tính phân cực mạnh cịn etyl acetat là dung mơi phân cực yếu nên khả năng hòa tan asiaticoside của ethanol và methanol sẽ tốt hơn etyl acetat.
Mặt khác methanol có khả năng chiết tốt hơn ethanol vì methanol có độ nhớt η =0.6(cp) và sức căng bề mặt δ =22.99(dyn/cm) trong khi đó ethanol η =1.2(cp) và δ =22.03(dyn/cm). Điều này được giải thích như sau dung mơi nào có độ nhớt và sức căng bề mặt càng thấp thì càng dễ thấm vào dược liệu tạo điều kiện chiết xuất dễ dàng hơn [3]. Nhưng ta thấy sự chênh lệch về sức căng bề mặt không đáng kể nên ta sử dụng yếu tố độ nhớt để so sánh hai kết quả này.
Sau khi khảo sát dung môi chúng tôi sẽ chọn ra dung môi được đánh giá là tốt nhất để tiến hành khảo sát các điều kiện tiếp theo. Theo kết quả khảo sát chúng tơi thu được thì methanol có khả năng chiết tốt hơn ethanol. Nhưng methanol có tính độc mạnh đối với con người nên chúng tơi quyết định chọn ethanol làm dung mơi chiết xuất, vì dung mơi này vì dung mơi này lại có nhiều ưu điểm hơn như: khơng gây độc nên có thể đảm bảo an cho sức khỏe con người, lại dễ kiếm, rẽ tiền.