3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.5. Phương pháp xác ựịnh hiệu giá kháng thể kháng virus Newcastle trong huyết thanh của gà sau khi sử dụng vacxin bằng phản ứng HI.
trong huyết thanh của gà sau khi sử dụng vacxin bằng phản ứng HI.
Virus Newcastle có ựặc tắnh gây ngưng kết hồng cầu gà, phản ứng HA sử dụng ựể xác ựịnh sự có mặt của virus, phản ứng HI ựể phân biệt virus với các virus khác và kiểm tra kháng thể trong huyết thanh của gà.
Chuẩn bị
- Chuẩn bị hồng cầu:
Lấy 10 ml máu tim gà, bổ sung thêm 5 ml Citrat Natri 5% ựể chống ựông máu. Ly tâm ựể hồng cầu lắng xuống rồi gạn bỏ phần nước trong ở trên, giữ lại hồng cầu. Cho nước muối sinh lý vào ựể rửa, trộn ựều, ly tâm, gạn bỏ phần nước trong và giữ lại hồng cầu. Tiến hành rửa bằng nước muối sinh lý 3
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 38
lần. Sau ựó dùng nước muối sinh lý pha loãng hồng cầu thành nồng ựộ 1%. Bảo quản ở nhiệt ựộ 2 Ờ 80C
- Chuẩn bị kháng nguyên:
Kháng nguyên là nước trứng tươi ựã gây nhiễm virus Newcastle chủng Lasota ựược bảo quản ở nhiệt ựộ (<-200C).
- Chuẩn bị huyết thanh:
Sử dụng syringe 5 ml vô trùng lấy máu gà ở các thời ựiểm kiểm tra, ựể nghiêng và cố ựịnh trong 15 phút cho máu ựông hoàn toàn. Chuyển vào phòng ấm 370C/ 1 giờ ựể huyết thanh tách chiết ựược nhiều. Chắt lấy huyết thanh, vô hoạt bổ thể 560C/ 30 phút và bảo quản ở nhiệt ựộ (<-200C) chờ ựến khi làm phản ứng.
Phương pháp tiến hành phản ứng
Ớ Phản ứng ngưng kết hồng cầu (HA):
− Nhỏ vào mỗi giếng của ựĩa nhựa 96 giếng 50 ộl dung dịch nước muối sinh lý vô trùng, pH = 7,0 Ờ 7,4.
− Nhỏ 50 ộl kháng nguyên virus vào giếng ựầu tiên.
− Pha loãng virus theo các bậc pha loãng ơ, Ử, 1/8, 1/16 Ầ
− Nhỏ 50 ộl hồng cầu gà 1% vào các giếng ựã pha loãng virus.
− Trộn ựều bằng cách lắc nhẹ nhàng ựĩa nhựa, ựể yên trong trong 25 phút ở nhiệt ựộ phòng.
− Trong quá trình tiến hành phản ứng dãy thứ 8 làm ựối chứng hồng cầu (chỉ có muối sinh lý và hồng cầu).
đọc kết quả: Kết quả ựược ựọc qua kắnh chuẩn ựộ chuyên dụng hoặc bằng cách nhìn nghiêng tấm nhựa chuẩn ựộ.
- Phản ứng dương tắnh: Hồng cầu ngưng kết thành những hạt lấm tấm màu ựỏ rải ựều ở ựáy giếng của ựĩa nhựa chuẩn ựộ.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 39
một cục máu tròn ựỏ ở chắnh giữa ựáy giếng.
- Hiệu giá phản phản ứng HA: là ựộ pha loãng virus lớn nhất mà tại ựó vẫn có hiện tượng ngưng kết hồng cầu thì ựược tắnh là 1 ựợn vị HA = 1HAU
* Phản ứng ngăn trở ngưng kết hồng cầu (HI):
Phản ứng HI ựược sử dụng thường quy trong chẩn ựoán và kiểm tra sự ựáp ứng miễn dịch của gà sau khi ựược sử dụng vacxin.
Tiến hành phản ứng
− Nhỏ 25 ộl dung dịch nước muối sinh lý vô trùng, pH = 7,0 Ờ 7,4 vào mỗi giếng của ựĩa nhựa 96 giếng.
− Nhỏ 25 ộl huyết thanh vào giếng ựầu tiên của ựĩa nhựa 96 giếng.
− Pha loãng huyết thanh theo cơ số 2 bằng pipet ựa kênh.
− Nhỏ vào mỗi giếng 25 ộl kháng nguyên virus Newcastle có chứa 4 ựơn vị HA, lắc ựều và ựể yên trong 60 phút/370C cho kháng nguyên và kháng thể (nếu có) kết hợp với nhau.
− Nhỏ vào mỗi giếng 25 ộl hồng cầu gà 1%, lắc nhẹ nhàng và ựể yên trong 30 phút.
− Làm ựối chứng:
+ đối chứng dương: dãy thứ 7 làm ựối chứng dương chỉ cho 50 ộl kháng nguyên và 50 ộl hồng cầu gà 1%.
+ đối chứng âm: dãy thứ 8 làm ựối chứng âm chỉ cho 50 ộl nước muối sinh lý và 50 ộl hồng cầu gà 1%.
đọc kết quả: Kết quả ựược ựọc qua kắnh chuẩn ựộ chuyên dụng hoặc bằng cách nhìn nghiêng tấm nhựa chuẩn ựộ.
- Phản ứng dương tắnh: Hồng cầu lắng xuống ựáy giếng thành cục tròn ựỏ giống giếng ựối chứng âm.
- Phản ứng âm tắnh: Hồng cầu ngưng kết thành những hạt lấm tấm màu ựỏ giống giếng ựối chứng dương.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 40
Hiệu giá phản ứng HI là ựộ pha loãng cao nhất của huyết thanh gây ra ngăn trở ngưng kết hồng cầu hoàn toàn của 4 ựơn vị HA kháng nguyên.