3. NỘI DUNG, NGUYÊN LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
3.4.6. Phương pháp xác ựịnh hiệu giá kháng thể kháng bệnh IBD và IB trong huyết thanh của gà sau khi sử dụng vacxin bằng phản ứng ELISA
trong huyết thanh của gà sau khi sử dụng vacxin bằng phản ứng ELISA Chuẩn bị nguyên liệu:
đĩa gắn kháng nguyên virus Gumboro, các dụng dịch pha loãng mẫu huyết thanh, cơ chất dung dịch dừng phản ứng, conjugate, ựối chứng huyết thanh dương tắnh và âm tắnh là các chất ựã ựược pha sẵn trong bộ kit.
Dung dịch rửa ựặc 10 lần (10x): Khi sử dụng pha loãng 10 lần với nước cất 2 lần và bảo quản ở nhiệt ựộ 40C/3 ngày hoặc ở tủ (-200C)/1 năm.
Chuẩn bị mẫu kiểm tra: Huyết thanh gà tại các thời ựiểm kiểm tra ựược vô hoạt bổ thể ở 560/30 phút và bảo quản ở nhiệt ựộ (-200C).
Tất cả các chất tham gia phản ứng phải ựược ựể ở nhiệt ựộ phòng (từ 18 Ờ 250C) trong 1 giờ trước khi làm phản ứng.
Tiến hành phản ứng:
Ớ Phát hiện kháng thể Gumboro bằng bộ kắt ELISA của hãng INDEX Pha huyết thanh với dung dịch pha loãng mẫu thành tỷ lệ 1:500.
Cho 100 ộl dung dịch ựối chứng âm vào giếng A1, 100 ộl dung dịch ựối chứng dương vào giếng B1 và 100 ộl dung dịch huyết thanh ựã pha loãng vão mỗi giếng của ựĩa nhựa 96 giếng.
để ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 30 phút.
Rửa ựĩa bằng nước rửa 3 lần, thể tắch rửa mỗi giếng là 350 ộl/ lần và làm khô các giếng.
Cho 100 ộl kháng thể (kháng thể ựã gắn enzyme) vào mỗi giếng. để ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 30 phút.
Rửa ựĩa bằng nước rửa 3 lần và làm khô ựĩa.
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 41
ựể trong bóng tối trong thời gian 15 phút.
Cho 100 ộl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.
Cho ựĩa phản ứng vào máy ựọc ELISA ở bước sóng 650 nm. + đọc kết quả:
Phản ứng (+) tắnh : S/P ≥ 0.2. Phản ứng (-) tắnh : S/P ≤ 0.2.
Ớ Phát hiện kháng thể IB bằng bộ kắt ELISA của hãng Synbiotic
Nhỏ 50 ộl dung dịch pha loãng mẫu vào các giếng ựối chứng và giếng cần kiểm tra mẫu.
Nhỏ 50 ộl dung dịch huyết thanh ựối chứng dương vào giếng A1, A3 và H11.
Dùng Pipet ựa kênh (8 Ờ 12 kênh) chuyển các mẫu huyết thanh ựã pha loãng vào các giếng tương ứng của ựĩa phản ứng
để ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 30 phút.
Rửa ựĩa bằng nước rửa 3 lần, thể tắch rửa mỗi giếng là 300 ộl/ lần và làm khô các giếng.
Cho 100 ộl kháng thể (kháng thể ựã gắn enzyme) vào mỗi giếng. để ở nhiệt ựộ phòng trong thời gian 30 phút.
Rửa ựĩa bằng nước rửa 3 lần và làm khô ựĩa.
Cho 100 ộl Substrate (cơ chất phù hợp với enzyme) vào mỗi giếng và ựể trong bóng tối trong thời gian 15 phút.
Cho 100 ộl dung dịch dừng phản ứng vào mỗi giếng.
Cho ựĩa phản ứng vào máy ựọc ELISA ở bước sóng 450 - 410 nm. + đọc kết quả:
Phản ứng (+) tắnh : S/P ≥ 0.15. Phản ứng (-) tắnh : S/P ≤ 0.15.
Hiệu giá chuẩn ựộ ELISA kháng thể IB ựược tắnh theo công thức: Log10 ỘHiệu giá chuẩn ựộỢ = (1,642 x log10 S/P) + 3,568 = a
Trường đại học Nông nghiệp Hà Nội Ờ Luận văn thạc sĩ khoa học nông nghiệp ẦẦẦẦẦẦẦẦ 42
Hiệu giá chuẩn ựộ kháng thể IB = 10A