3.2.1. Phân lập và định danh loài
3.2.1.1. Phương pháp thu mẫu bệnh
- Mẫu bệnh thu từ những củ gừng có triệu chứng vết bệnh ban đầu điển hình rửa sạch bằng nước để loại bỏ tạp chất. Sau đó khử trùng bằng cồn 70o, rửa lại bằng nước cất vô trùng.
- Mẫu bệnh được ủ trong hộp vô trùng bọc túi PE và ghi đầy đủ thông tin cần thiết (địa điểm, tên giống, ngày tháng thu mẫu…).
Làm thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử Giám định lại dưới kính hiển vi
Giữ mẫu
Đồ án tốt nghiệp
Hình 3.1. Sơ đồ phân lập nấm F.oxysporum trên gừng
Thuyết minh quy trình
Khử trùng và ủ mẫu bệnh
Sau khi thu thập mẫu được đưa về phòng thí nghiệm, tại đây những củ gừng có vết bệnh điển hình được rửa dưới vòi nước sạch để loại bỏ tạp chất và bụi bẩn bám trên bề mặt. Tiếp theo khử trùng bằng cồn 70o sau đó rửa sạch lại bằng nước cất vô trùng và để ráo nước [4].
Đặt củ gừng bệnh lên giấy được phun ẩm bằng nước cất vô trùng, sau đó cho vào hộp nhựa đã được khử trùng bằng cồn 70o, bao bọc lại bằng bì nilong, trên bề mặt có đục lỗ nhỏ tạo điều kiện thuận lợi cho nấm phát triển. Cuối cùng cho vào tủ ấm ủ ở nhiệt độ 25oC. Sau khoảng 2 - 4 ngày quan sát khi thấy xuất hiện có bào tử, làm giám định bào tử gây bệnh thối khô trên củ gừng. Sau khi giám định sơ bộ ta tiến hành phân lập nấm trên môi trường thích hợp.
Phân lập nấm
Sau khi tiến hành ủ bệnh, khi quan sát thấy có bào tử trên vết bệnh được ủ thì tiến hành lấy tăm vô trùng chấm vào mô bệnh và cấy lên đĩa peptri chứa môi trường 1/2 PDA. Đĩa được ủ ở nhiệt độ thích hợp 25oC trong khoảng 2 - 4 ngày bắt thì đầu quan sát bào tử.
Cấy truyền
Kiểm tra các đĩa hằng ngày, mô tả sự phát triển của sợi nấm và quan sát bào tử. Tiến hành cấy truyền bằng cách dùng dao cắt một miếng thạch có kích thước (2 x 2 mm) từ rìa mỗi tản nấm sang môi trường 1/2 PDA [4].
Làm thuần
Giai đoạn cuối cùng trong việc phân lập nấm là làm thuần mẫu nấm. Quan sát dưới kính hiển vi thấy bào tử thuần nhất tiến hành làm thuần. Chỉ cho một bào tử hoặc một đỉnh sinh trưởng được cấy sang môi trường sạch để đảm bảo nấm được cấy là hoàn toàn thuần bằng phương pháp cấy đơn bào tử.
Giám định nấm bằng kính hiển vi
Khi tản nấm đã xuất hiện bào tử, thường trong 4 ngày, tiến hành làm tiêu bản quan sát hình thái sợi nấm và bào tử ở vật kính 100, khi kết quả giám định là đúng với nấm phân lập thì chụp hình và giữ mẫu ở 4oC [7].
Cấy lên môi trường 1/2 PDA
Nguyên tắc định danh dựa trên sự khác biệt trình tự nucleotide ở trên vùng 28S đối với vi nấm giữa các loài khác nhau. Giải trình tự gen 28S rRNA và tra cứu trên BLAST SEARCH để xác định loài nấm.