3.2.2.1. Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh của F.oxysporum bằng lây bệnh nhân tạo trong phòng thí nghiệm
F.oxysporum được nuôi cấy trên môi trường 1/2 PDA.
Nấm ủ trong tủ ấm ở 25oC, sau 7 ngày tiến hành thu nhận bào tử.
Thử khả năng lây bệnh trên củ gừng sau thu hoạch ở các nồng độ khác nhau: 100 bào tử/ml, 104 bào tử/ml, 105 bào tử/ml, 106 bào tử/ml, 107 bào tử/ml.
Nồng độ bào tử được xác định bằng buồng đếm hồng cầu Neubauer.
Thí nghiệm được tiến hành với 6 công thức (CT) và 3 lần lặp lại. Mỗi củ lây 2 vết đồng đều trên tất cả các củ [3].
- Các bước tiến hành:
+ Mẫu gừng lành bệnh mua về được rửa qua vòi nước sạch, sau đó khử trùng bằng cồn 70o và rửa lại bằng nước cất vô trùng.
+ Tiến hành lây 2 vết bệnh giống nhau trên mỗi củ bằng cách tạo vết thương trên củ, nhỏ 5 µl bào tử ở các CT thí nghiệm trên vào vết thương và để khô tự nhiên.
+ Đặt mẫu trên giấy vô trùng, đưa vào hộp nhựa đã khử trùng bằng cồn 70o. Phun nước vô trùng tạo độ ẩm cho nấm phát triển.
Bảng 3.1. Bố trí thí nghiệm xác định ngưỡng gây bệnh F.oxysporum trên củ gừng.
Công thức Nồng độ ( bào tử/ml) ĐC 100 CT1 104 CT2 105 CT3 106 CT4 107
- Các chỉ tiêu theo dõi:
Dùng tăm vô trùng chấm vào mô bệnh
Đồ án tốt nghiệp
+ Đường kính vết bệnh (mm)
+ Mức độ phát triển bệnh được xác định theo đường cong tiến triển bệnh AUDPC (Area Under Disease Progress Curve) theo Campbell và Madden (1990).
Trong đó:
AUDPC: đường cong tiến triển chung của bệnh.
yi, yi + 1: tỷ lệ bệnh trong lần theo dõi thứ i và thứ i + 1. ti, ti + 1: thời gian theo dõi bệnh ở lần thứ i và thứ i + 1 (giờ). n: tổng số lần theo dõi bệnh.
3.2.2.2. Xác định thời gian nảy mầm của bào tử F.oxysporum
- Tiến hành
+ Hút 20 môi trường cho vào lam lõm
+ Hút 4 µl huyền phù bào tử nồng độ 106 bào tử/ml cho vào môi trường đã chuẩn bị.
+ Để yên trong tủ cấy vô trùng khoảng 5 phút, đậy kín. Ủ ở 25oC cứ sau 1 giờ quan sát và đếm số lượng bào tử nảy mầm.
Mỗi công thức lặp lại 3 lần. - Chỉ tiêu theo dõi:
Thời gian nảy mầm của bào tử: tiến hành quan sát xác định số bào tử nảy mầm [33].
3.2.2.3. Đánh giá khả năng kháng F.oxysporum của natri benzoat và natri sulfit ở điều kiện in vitro
Ảnh hưởng của natri benzoat và natri sulfit đến đường kính tản nấm
F.oxysporum
- Tiến hành thí nghiệm
Các muối vô cơ như natri benzoat và natri sulfit được khảo sát ở các nồng độ khác nhau: 0%; 0,02%; 0,04%; 0,08%; 0,16 % đối với natri benzoat và các công thức: 0%; 0,1%; 0,2%; 0,4%; 0,8%; 1,6% đối với natri sulfit trên môi trường 1/2 PDA ở điều kiện in vitro để đánh giá khả năng ức chế nấm
- Cách tiến hành:
+ Dùng pipetman hút natri benzoat và natri sulfit vào các bình tam giác chứa môi trường PDA [phụ lục 1] (đã tiệt trùng, để nguội ở nhiệt độ 450C) để đạt đến nồng độ yêu cầu.
+ Cho 14ml môi trường lần lượt vào các đĩa peptri vô trùng để đông. + Khuẩn lạc sau khi nuôi cấy 7 ngày được cắt từ rìa khuẩn lạc và đặt vào giữa môi trường đã chuẩn bị.
+ Ủ ở nhiệt độ 250C, quan sát, đo đường kính 48 giờ một lần.
+ Thí nghiệm được thực hiện 6 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần [13].
- Chỉ tiêu đánh giá:
+ Hình thái tản nấm, đường kính tản nấm (mm)
+ Xác định hiệu lực ức chế được tính theo tỷ lệ (%) ức chế tốc độ phát triển của đường kính tản nấm HLUC (%)
HLUC (%) = × 100% Trong đó:
C: tỷ lệ nảy mầm bào tử ở công thức đối chứng (%) T: tỷ lệ nảy mầm bào tử ở công thức thí nghiệm (%)
Ảnh hưởng của natri benzoat và natri sulfit đến sinh khối nấm Fusarium
oxysporum
- Cách tiến hành:
+ Hút 20 µl huyền phù bào tử nồng độ 106 bào tử/ml đã chuẩn bị vào chai thủy tinh có chứa môi trường đã chuẩn bị.
+ Tiến hành nuôi cấy trong thời gian 7 ngày ở điều kiện 25oC.
+ Thu sinh khối nấm bằng cách lọc trên giấy đã sấy đến khối lượng không đổi, sau đó thu sinh khối khô bằng cách sấy đến khối lượng không đổi ở 55oC [13], [7], [33].
- Chỉ tiêu theo dõi
Trong đó:
C: sinh khối khô ở công thức đối chứng T: sinh khối tươi khô ở công thức thí nghiệm
Ảnh hưởng của natri benzoat, natri sulfit đến tỷ lệ nảy mầm của bào tử F.oxysporum
- Tiến hành
Hút 20 µl môi trường PDA có chứa natri benzoat hoặc natri sulfit ở các công thức khảo sát vào lam lõm được đặt trong đĩa petri vô trùng, để nguội cho môi trường đông, sau đó cấy 4 µl huyền phù bào tử ở nồng độ 106 bào tử/ml trên môi trường thạch. Để yên trong tủ cấy vô trùng khoảng 5 phút, đậy kín và ủ ở nhiệt độ 25oC. Sau 6 và 12 giờ bắt đầu quan sát sự nảy mầm của bào tử và sự phát triển hệ sợi nấm. Thí nghiệm được thực hiện trên 6 công thức, mỗi công thức lặp lại 3 lần [13].
- Tính kết quả:
+ Tỷ lệ nảy mầm của bào tử ở các công thức + Hiệu lực ức chế sự nảy mầm của bào tử nấm HLUC (%) = × 100% Trong đó:
C: tỷ lệ nảy mầm bào tử ở công thức đối chứng (%) T: tỷ lệ nảy mầm bào tử ở công thức thí nghiệm (%)