3.4.1. Khảo sát sự biểu hiện c-fos trên não chuột
Thăm dò tỷ lệ pha loãng các kháng thể dùng cho nghiên cứu
Theo hướng dẫn của hãng Sigma về độ pha loãng của kháng thể khi sử dụng cho phương pháp hóa mô miễn dịch là 1/1000 (đối với kháng thể sơ cấp) và 1/500 (đối với kháng thể thứ cấp), 3 nồng độ kháng thể được pha loăng khác nhau để tiến hành khảo sát như sau:
- Độ pha loãng 1: Kháng thể sơ cấp (kháng thế kháng c-fos): 1/1000
Kháng thể thứ cấp (kháng thể tạo phức hợp tạo màu): 1/500 - Độ pha loãng 2: Kháng thể sơ cấp (kháng thế kháng c-fos): 1/500
95
- Độ pha loãng 3: Kháng thể sơ cấp (kháng thế kháng c-fos): 1/100
Kháng thể thứ cấp (kháng thể tạo phức hợp tạo màu): 1/20 Do không có mẫu đối chứng dương, nên chuột được cho uống 3-MCPD ở liều cao nhất (100 mg/kg) được chọn để lấy mẫu mô cho thí nghiệm này. Mẫu mô não được lấy ngay sau khi kết thúc thời gian phơi nhiễm 3-MCPD, vì như đã đề cập trong phần tổng quan và qua theo dõi trên một số tài liệu khác, c-fos là gen biểu hiện sớm với mức biểu hiện cao nhất là từ 24-48 giờ sau khi được kích hoạt [40],[45],[70]. Kết quả thử nghiệm cho thấy ở 2 độ pha loãng 1 và 2, hầu như không phát hiện bất kỳ một tín hiệu nào cho thấy có sự biểu hiện c-fos dương tính (quan sát trên 100 lát cắt mô ở nhiều vị trí khác nhau). Ở độ pha loãng 3 (kháng thể sơ cấp kháng c-fos: 1/100 + kháng thể thứ cấp tạo màu: 1/20) cho một số tín hiệu bắt màu nâu ở vùng vỏ não. Vì thế độ pha loãng này được chọn để đánh giá sự biểu hiện của c-fos dưới tác động của 3-MCPD (hình 3.18).
Hình 3.18. Sự biểu hiện c-fos ở độ pha loãng 1/100 (kháng thể sơ cấp kháng c-fos) và 1/20 (kháng thể thứ cấp-cơ chất tạo màu)
Khảo sát sự biểu hiện c-fos sau khi gây phơi nhiễm 3-MCPD liều 10 mg/kg trong 24 giờ
96
Trong nghiên cứu này, vùng võ não giữa được chọn để quan sát và các mẫu mô cắt từ vị trí cách điểm Bregma trong khoảng từ 0.0 đến -1.0 mm (hình 3.19).
Chuột được gây phơi nhiễm 3-MCPD bằng đường uống ở liều 10 mg/kg trong 24 giờ hoặc 48 giờ hoặc 72 giờ. Sau khi đạt thời gian phơi nhiễm, chuột được giết và tách ngay não, sau đó xử lý và cắt lát mô để nhuộm ngay.
Quan sát sự nhuộm màu bằng hóa mô miễn dịch của các lát cắt não, trong khoảng từ Bregma 0.0 đến -1.0 mm, cho thấy 3-MCPD liều 10 mg/kg hầu như không gây kích hoạt sự biểu hiện c-fos ở 3 thời điểm gây phơi nhiễm. Mặc dù kết quả chỉ trình bày trên một số mẫu mô cắt điển hình, nhưng trên thực tế rất nhiều lắt mô cắt được quan sát, và vùng quan sát rộng hơn rất nhiều (khoảng 100 lát cắt/não).
Hình 3.19. Sự biểu hiện c-fos ở vùng vỏ não sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 10 mg/kg trong 24 giờ ở các lô thử nghiệm
97
Khảo sát sự biểu hiện c-fos sau khi gây phơi nhiễm 3-MCPD liều 50 mg/kg
trong 24 giờ
Tương tự như khảo sát ở liều 10 mg/kg, ở liều 50 mg/kg, 3-MCPD cũng không gây biểu hiện c-fos trên các vùng não đã được quan sát.
Hình 3.20. Sự biểu hiện c-fos ở vùng vỏ não sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 50 mg/kg trong 24 giờ ở các lô thử nghiệm
3-MCPD 50 mg/kg sau 24 giờ
3-MCPD 50 mg/kg sau 48 giờ 3-MCPD 50 mg/kg sau 72 giờ
3-MCPD 50 mg/kg sau 24 giờ
98
Khảo sát sự biểu hiện c-fos sau khi gây phơi nhiễm 3-MCPD liều 100 mg/kg
trong 24 giờ
Phơi nhiễm 24 giờ: trong thí nghiệm này, 3-MCPD được sử dụng với liều rất cao
100 mg/kg. Tuy nhiên không phát hiện não chuột có dấu hiệu biểu hiện c-fos sau khi uống 3-MCPD trong 24 giờ (hình 3.21).
Hình 3.21. Sự biểu hiện c-fos ở vùng vỏ não sau khi gây phơi nhiễm 3-MCPD liều 100 mg/kg trong 24 giờ ở các lô thử nghiệm
Phơi nhiễm 48 giờ: với thời gian phơi nhiễm 24 giờ, 3-MCPD không gây biểu hiện c-fos nhưng khi cho phơi nhiễm 48 giờ, sự biểu hiện c-fos được quan sát, chủ yếu ở vùng vỏ não. Sự biểu hiện c-fos không tập trung trên một vị trí mà được trải ra một cách rải rác. Những vùng khác ngoài vỏ não hầu như không có sự biểu hiện của c-fos (hình 3.22).
99 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.22. Sự biểu hiện c-fos ở vùng vỏ não sau khi gây phơi nhiễm 3-MCPD liều 100 mg/kg trong 48 giờ
Phơi nhiễm trong 72 giờ: tương tự, ở thời điểm 72 giờ, 3-MCPD cũng gây biểu hiện c-fos rải rác trong vùng vỏ não. Mặc dù không thể xác định chính xác được mức độ biểu hiện, nhưng mật độ tín hiệu dương tính có vẻ thấp hơn so với thời điểm 48 giờ (hình 3.23).
Bảng 3.22. Sự biểu hiện c-fos ở các lô thử nghiệm sau khi phơi nhiễm 3-MCPD
Thời gian phơi nhiễm
Trung bình số tín hiệu c-fos dương tính / lát cắt mô 3-MCPD 10 mg/kg 3-MCPD 50 mg/kg 3-MCPD 100 mg/kg
Phơi nhiễm 24 giờ (n=15) 0 0 0
Phơi nhiễm 48 giờ (n=15) 0 0 20 ± 4
100
Hình 3.23. Sự biểu hiện c-fos ở vùng vỏ não sau khi phơi nhiễm 3-MCPD liều 100 mg/kg trong 72 giờ
Như vậy trên sự biểu hiện c-fos, 3-MCPD có các tác động sau:
Liều 10 mg/kg và 50 mg/kg: không gây biểu hiện c-fos khi cho phơi nhiễm trong 24, 48 và 72 giờ
Liều 100 mg/kg: gây biểu hiện c-fos chủ yếu ở vỏ não, trong 2 thời điểm khảo sát là 48 giờ và 72 giờ. Ở thời điểm 24 giờ, không quan sát thấy có sự biểu hiện c-fos.
3.4.2. Khảo sát tác động của 3-MCPD trên sự thoái hóa tế bào thần kinh não chuột bằng phương pháp nhuộm cresyl violet
Trong nghiên cứu này, tác động của 3-MCPD cũng được khảo sát ở các liều 10mg/kg, 50mg/kg, và 100mg/kg trên sự thoái hóa tế bào thần kinh ở vùng hồi hải mã (hippocampus) sau khi cho chuột uống 3-MCPD trong 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 2 tuần. Vùng hồi hải mã được chọn do cấu trúc của vùng này dễ quan sát so sánh và đồng thời đây là vùng dễ bị tổn thương dưới tác động của các độc tố thần kinh. Tác động của 3-MCPD trên vùng hồi hải mã được trình bày trong các hình 3.24, 3.25, 3.26, 3.27 và 3.28 dưới đây.
3-MCPD 100 mg/kg sau 72 giờ (vật kính 4)
3-MCPD 100 mg/kg sau 72 giờ (vật kính 4)
101
Hình 3.24. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã ở các lô thử nghiệm sau 24 giờ phơi nhiễm 3-MCPD
Hình 3.25. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã ở các lô thử nghiệm sau 48 và 72 giờ phơi nhiễm 3-MCPD
102
Kết quả nhuộm màu bằng cresyl violet (hình 3.24 và 3.25) cho thấy hầu như không có sự khác biệt rõ rệt nào giữa các lô uống 3-MCPD ở các liều 10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg so với lô chứng. Mặc dù cường độ bắt màu khác nhau (lô chứng bắt màu thường đậm hơn) nhưng điều này không phản ánh bất kỳ một biểu hiện nào cho thấy có sự thoái hóa thần kinh.
Ở độ phóng đại cao hơn (hình 3.26), lô chứng cho thấy hình ảnh các thân tế bào khá rõ và có ranh giới rõ rệt, trong khi lô uống 3-MCPD 10 mg/kg và 50 mg/kg có hình ảnh thân tế bào không rõ; tuy nhiên ở lô 3-MCPD 100 mg/kg, hình ảnh lại rõ trở lại. Như vậy, đây có thể là do kỹ thuật chưa hoàn chỉnh, chứ chưa hẳn là một tác động độc hại của 3-MCPD trên vùng hồi hải mã.
Tóm lại, ở giai đoạn cấp tính (từ 24-72 giờ), 3-MCPD ở các liều 10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg hầu như chưa thể hiện tác động gây thoái hóa tế bào thần kinh nào ở vùng hồi hải mã.
103
Hình 3.26. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã với độ phóng đại cao hơn (x 1000) sau 72 giờ phơi nhiễm 3-MCPD
104
Hình 3.27. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã ở các lô thử nghiệm sau 2 tuần phơi nhiễm 3-MCPD
105
Kết quả nhuộm màu bằng cresyl violet sau 2 tuần cho uống 3-MCPD được trình bày trong hình 3.27, 3.28. Ở thí nghiệm này, tất cả các chuột uống liều 100 mg/kg đều bị tử vong vì thế kết quả trình bày chỉ còn ở 2 liều là 10 mg/kg và 50 mg/kg.
Tương tự như các kết quả trên, sự nhuộm màu vùng hồi hải mã bằng cresyl violet cho thấy hầu như không có sự khác biệt rõ rệt nào giữa các lô uống 3-MCPD ở các liều 10 mg/kg và 50 mg/kg so với lô chứng. Mặc dù cường độ bắt màu ở lô chứng cũng có vẻ đậm hơn và mật độ tế bào cao hơn. Tuy nhiên, chưa thể có bất kỳ kết luận nào về hiện tương này vì kết quả thu được chưa mang tính hệ thống và lặp lại (hình 3.28). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 3.28. Sự bắt màu cresyl violet của vùng hồi hải mã với độ phóng đại cao hơn (x 1000) sau 2 tuần phơi nhiễm 3-MCPD
Tóm lại, đánh giá bằng phương pháp nhuộm cresyl violet chưa cho thấy tác động gây thoái hóa tế bào thần kinh của 3-MCPD sau 2 tuần phơi nhiễm.
106
CHƯƠNG 4
BÀN LUẬN
Các nghiên cứu độc tính của 3-MCPD đã thực hiện cho đến nay chủ yếu tập trung trên thận và cơ quan sinh sản với những kết quả thu được rất đáng kể. Những vấn đề tồn tại khi đề cập đến độc tính của 3-MCPD thuộc về ảnh hưởng của 3-MCPD trên huyết học, gan và tế bào thần kinh. Đồng thời tác động của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể cũng chưa rõ ràng khi kết quả thu được trong các nghiên cứu về khả năng gây đột biến gen và tiềm năng gây ung thư còn chưa cho thấy sự lặp lại về tác động của 3-MCPD. Vì vậy, việc tiến hành nghiên cứu sâu hơn tác động của 3-MCPD về mặt huyết học, nhiễm sắc thể, gan và thần kinh là cần thiết.
4.1. Chọn liều nghiên cứu và thời gian thử nghiệm
- Trong nghiên cứu của chúng tôi, liều phơi nhiễm 3-MCPD trên chuột thử nghiệm được chọn dựa trên cơ sở liều thấp nhất có khả năng gây độc của 3-MCPD là 1,1 mg/kg [97]; đồng thời cũng dựa trên cơ sở tham khảo từ các công trình đã công bố khi nghiên cứu về độc tính của 3-MCPD với khoảng liều sử dụng dao động từ 1-100 mg/kg thể trọng. Liều 3-MCPD thử nghiệm sẽ được tăng dần từ liều thấp nhất lên 10 lần, 20 lần, 40 lần, 100 lần để có thể đánh giá được mức liều gây tác động của 3-MCPD trên các cơ quan theo mục tiêu (trên gan, máu và thần kinh) cũng như theo dõi được sự đáp ứng theo liều nếu có.
- Đối với thời gian thử nghiệm, chúng tôi cũng tham khảo các công trình đã công bố để thiết kế thời gian thử nghiệm hợp lý, đồng thời dựa trên cơ sở đánh giá các tác động chưa rõ ràng của 3-MCPD trên các cơ quan mục tiêu là gan, máu và thần kinh. Thời gian thử nghiệm cũng được thiết kế sao cho phù hợp với tính chất của thử nghiệm như thử nghiệm trong thời gian ngắn (cấp tính) đối với biểu hiện c-fos do c- fos là gen chỉ biểu hiện sau khi có yếu tố tác động trong vòng 24 giờ. Thử nghiệm trong thời gian dài (6 tháng, 12 tháng) được chọn khi một số thử nghiệm độc tính trong thời gian ngắn chưa cho thấy tác động rõ ràng của 3-MCPD như tác động trên gan, huyết học.
107
đến trên cơ sở thử nghiệm độc tính cấp với liều cao và độc tính mạn với liều thấp hơn nhằm đánh giá rõ hơn mức độ gây độc của 3-MCPD.
4.2. Độc tính của 3-MCPD trên huyết học
- Qua phân tích các công trình đã nghiên cứu về độc tính của 3-MCPD cho thấy hầu hết các nghiên cứu liên quan đến lĩnh vực huyết học được thực hiện trong thời gian ngắn từ 4 đến 6 tuần; chỉ có một nghiên cứu thực hiện trong 13 tuần. So sánh với các nghiên cứu đã thực hiện, thiết kế trong nghiên cứu này xác định mục tiêu đánh giá độc tính của 3-MCPD theo các mốc thời gian trải dài từ pha cấp tính, bán cấp tính và mạn tính (6 tháng, 12 tháng). Với sự khác biệt này, tác động của 3- MCPD trên huyết học sẽ được đánh giá bao quát và rõ ràng hơn.
- Chỉ tiêu để đánh giá trong nghiên cứu của chúng tôi có khác biệt với các nghiên cứu trước đây là thời gian đông cầm máu. Ngoài ra, với thời gian nghiên cứu dài hơn, chỉ tiêu đánh giá về công thức máu và hình thái tế bào máu cho những khác biệt rõ rệt hơn.
Khái quát các nghiên cứu về độc tính trên tế bào máu ngoại vi của 3-MCPD đã thực hiện, với liều lượng dao động từ 9 mg/kg/ngày cho đến 60 mg/kg/ngày, phần lớn các kết quả cho thấy 3-MCPD ở liều từ 30 mg/kg/ngày gây thiếu máu, suy tủy, giảm bạch cầu [20],[56].
Trong nghiên cứu của Kirton và cộng sự (1970), phơi nhiễm 3-MCPD liều 30 mg/kg trong 6 tuần trên khỉ gây thiếu máu, giảm bạch cầu, giảm tiểu cầu và suy tủy xương [56]. Phơi nhiễm 3-MCPD trong 13 tuần gây ra sự tăng nhẹ chỉ số thể tích trung bình hồng cầu (MCV) ở chuột đực (liều 400 ppm) và chuột cái (liều 100 ppm và 200 ppm), số lượng bạch cầu đơn nhân tăng ở chuột đực khi uống liều 100 ppm nhưng nhìn chung không có sự khác biệt có ý nghĩa giữa nhóm chứng và nhóm uống 3-MCPD [20].
So sánh kết quả thí nghiệm của chúng tôi với các kết quả thí nghiệm nêu trên, chúng tôi nhận thấy có những điểm tương đồng và khác biệt sau:
4.2.1. Trên chỉ số bạch cầu
108
khuynh hướng gây giảm bạch cầu đơn nhân, gây giảm số lượng bạch cầu trung tính, và gây tăng bạch cầu lympho. Trong khi đó, ở nghiên cứu của Kirton và cộng sự (1970) trên khỉ, kết quả cho thấy 3-MCPD (30 mg/kg) gây suy tủy, giảm bạch cầu, còn nghiên cứu của Cho và các cộng sự (2008) trên chuột nhắt chủng B6C3F1 trong 13 tuần, nhìn chung không cho thấy tác động nào của 3-MCPD. Vì thế, chúng tôi cho rằng thiết kế về thời gian, liều thử nghiệm và chủng thú vật thí nghiệm có thể cho những kết quả khác nhau.
Sau 12 tháng, kết quả của chúng tôi cho thấy 3-MCPD gây giảm tổng lượng bạch cầu, giảm bạch cầu trung tính và bạch cầu lympho, phù hợp với nghiên cứu của Kirton và cộng sự (1970) [56], cũng như của Cho và cộng sự (về sự tăng bạch cầu đơn nhân, dù ở nghiên cứu của Cho là chưa có ý nghĩa thống kê) [20]. Đồng thời, chúng tôi còn nhận thấy khả năng tác động mạnh mẽ của 3-MCPD lên lympho bào, tạo ra những lympho có hình thái đa hình và những lympho bào bất thường.
Những biến đổi nói chung về số lượng các loại bạch cầu cũng như về hình thái của bạch cầu lympho có thể là do tác động gây nhiễm độc mạn tính khác nhau của 3- MCPD trên dòng tế bào tủy (tế bào gốc đa năng tạo bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân) và trên dòng tế bào lympho (tạo lympho B và lympho T), làm rối loạn sự tăng sinh và biệt hóa các dòng bạch cầu. Bên cạnh đó, 3-MCPD còn làm thay đổi hình thái của bạch cầu lympho và vì vậy 3-MCPD có thể là một yếu tố nguy cơ gây ung thư. Trong nghiên cứu của chúng tôi, kết quả quan sát được chủ yếu trên các dòng bạch cầu ở máu ngoại vi. Chúng tôi chưa tiến hành được kỹ thuật phết tủy để