ở pha cấp tính, bán cấp tính và mạn tính
46
pha cấp tính, bán cấp tính và mạn tính.
Các bước tiến hành:
Bước 1: cho chuột thử nghiệm uống 3-MCPD hàng ngày với liều từ 1 mg/kg đến 100 mg/kg trong thời gian tương ứng với các pha cấp tính (24, 48, 72 giờ và 2 tuần), bán cấp tính (3 tháng) và mạn tính (6 tháng, 12 tháng).
Bước 2: đánh giá độc tính của 3-MCPD thông qua sự thành lập vi nhân trong hồng cầu bằng phương pháp phết máu ngoại vi.
Tóm tắt thử nghiệm đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể được mô tả trong sơ đồ 2.2.
Sơ đồ 2.2. Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên nhiễm sắc thể
Phương pháp khảo sát:
Máu được lấy trực tiếp từ đuôi chuột và được phết thành lớp mỏng trên lam kính, sau đó được để khô rồi cố định bằng methanol trong khoảng 1 phút. Để khô lam kính rồi nhuộm bằng thuốc thử Giemsa trong 30 phút. Sau khi nhuộm, rửa lam kính bằng nước rồi để khô. Quan sát trên kính hiển vi dưới vật kính 10 và 100 để tìm và phát hiện vi nhân xuất hiện trong hồng cầu [106].
Chuột được chia thành các lô chứng và lô thử (uống 3-MCPD liều khác nhau), mỗi lô 6-20 con, với thời gian phơi nhiễm như sau:
Chuột thử nghiệm
Đạt thời điểm đánh giá độc tính
Gây phơi nhiễm 3- MCPD
Phết máu ngoại vi
Đánh giá độc tính trên nhiễm sắc thể dựa vào: -Sự xuất hiện của vi nhân
47
Thời gian phơi nhiễm Dịch uống Lô chứng Lô thử
24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 2 tuần Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày; 100 mg/kg/ngày 3 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày 6 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày; 40 mg/kg/ngày 12 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày
2.3.3. Đánh giá độc tính mạn của 3-MCPD trên gan
Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên gan được thực hiện trong thời gian 6 tháng và 12 tháng.
Các bước tiến hành:
Bước 1: cho chuột thử nghiệm uống 3-MCPD hàng ngày với liều từ 1 mg/kg đến 40 mg/kg trong thời gian 6 tháng và 12 tháng.
Bước 2: đánh giá độc tính của 3-MCPD qua thông số các enzym gan và giải phẫu mô học gan.
Độc tính của 3-MCPD trên gan trong những nghiên cứu đã công bố được đánh giá trong thời gian từ 4 đến 12 tuần với liều từ 30-70 mg/kg/ngày thông qua các thông số về enzym aminotransferase và quan sát đại thể, vi thể trên mẫu gan của chuột cống [63], [73].
Trong nghiên cứu này, độc tính mạn tính của 3-MCPD trên gan được tiến hành nghiên cứu trong thời gian dài hơn trên chuột nhắt. Tóm tắt quy trình thử nghiệm được mô tả trong sơ đồ 2.3.
48
Sơ đồ 2.3. Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên gan
Chuột được phân chia thành các lô chứng và lô thử (uống 3-MCPD), mỗi lô 20 con, với thời gian phơi nhiễm như sau:
Thời gian phơi nhiễm Dịch uống Lô chứng Lô thử
6 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày; 20 mg/kg/ngày 12 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.3.3.1. Phương pháp lấy mẫu máu và xét nghiệm các enzym gan
Các mẫu máu được lấy từ tim chuột sau khi đã gây mê bằng đá CO2 và chứa trong các ống nhựa chuyên dụng có EDTA để chống đông máu (được cung cấp bởi bệnh viện Chợ Rẫy).
- Mẫu máu sau khi lấy được ly tâm để tách lấy phần huyết tương. Huyết tương thu được phải trong, màu vàng nhạt, không có dấu hiệu hồng cầu bị huyết giải, được
Đánh giá tỷ số
Khối lượng gan/thể trọng chuột
Lấy máu toàn phần Lấy gan chuột
Gây phơi nhiễm 3-MCPD Chuột thử nghiệm
Đạt thời điểm đánh giá độc tính
Gây mê chuột
Đánh giá độc tính trên gan qua:
- Hoạt tính ALT
- Hoạt tính AST
Đánh giá độc tính trên gan qua: - Quan sát đại thể
49
đem đo ngay hay bảo quản lạnh ở 4oC và đo trong vòng 48 giờ.
- Việc định lượng các enzym gan được tiến hành trên máy xét nghiệm sinh hóa Tecno 168 tại bộ môn Sinh hóa, Khoa Dược.
* Phương pháp xác định hoạt tính ALT (Alanin amino transferase) và AST (Aspartat amino transferase) [10]
- Nguyên tắc: xác định hoạt tính enzym ALT và AST bằng phương pháp động học theo nguyên tắc như sau:
LDH: Lactat dehydrogenase
MDH: Malat dehydrogenase
Coenzym dạng khử NADH hấp thu tia tử ngoại ở bước sóng 340 nm trong khi dạng oxy hóa NAD+ không hấp thu. Tốc độ giảm sự hấp thu được tính theo phút, tỷ lệ với hoạt độ enzym ALT, AST.
- Tiến hành: trộn đều 1 ml thuốc thử với 100 l huyết tương, để ủ 1 phút. Đo sự thay đổi mật độ quang (OD) cách 1 phút trong 3 phút ở bước sóng 340 nm, nhiệt độ 30oC, cốc đo 1 cm, đọc đối chiếu với mẫu nước cất.
- Tính toán: U/L = OD/ 1 phút x 1746
2.3.3.2. Xét nghiệm giải phẫu mô học gan
Chuột được gây mê bằng đá CO2 và ổ bụng được mở để tiến hành cắt lấy gan. Trước khi cắt gan tĩnh mạch cửa được cắt đứt để toàn bộ máu trong gan thoát hết ra ngoài. Cắt lấy gan và cố định gan trong dung dịch formol 4% pha trong dung dịch đệm phosphat.
Mẫu gan được gửi cho bộ môn Giải phẫu bệnh - Khoa Y - ĐH Y Dược Thành Phố Hồ Chí Minh đọc mẫu.
Oxaloacetat + NADH + H+ MDH L-Malat + NAD+ L-Aspartat + α-ketoglutarat Oxaloacetat + L-Glutamat
AST
Pyruvat + NADH + H+ L-Lactat + NAD+
LDH (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
L-Alanin + α-ketoglutarat Pyruvat + L-Glutamat
50
Quan sát đại thể gan:
Được tiến hành bằng việc so sánh màu sắc, hình dạng của gan giữa các lô uống 3- MCPD với lô chứng. Sự hình thành các dấu hiệu bất thường ở các lô thí nghiệm sẽ được ghi nhận và thống kê.
Quan sát vi thể gan:
Cấu trúc, hình thái tế bào gan trong các tiểu thùy gan được xem xét để tìm ra những cấu trúc, hình thái bất thường so với gan bình thường. Các chỉ tiêu như viêm gan hay nghịch sản sẽ được đánh giá và so sánh giữa các lô thí nghiệm.
2.3.4. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên thần kinh
Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên thần kinh được thực hiện trong pha cấp tính
Các bước tiến hành:
Bước 1: cho chuột thử nghiệm uống 3-MCPD với liều từ 10 mg/kg đến 100
mg/kg trong thời gian 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 2 tuần.
Bước 2: đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não chuột dựa trên phương pháp hóa mô miễn dịch của sự biểu hiện c-fos và phương pháp nhuộm cresyl violet để phát hiện sự thoái hóa tế bào thần kinh.
Quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não được mô tả trong sơ đồ 2.4.
Sơ đồ 2.4. Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên não chuột
Gây phơi nhiễm 3-MCPD Chuột thử nghiệm
Đạt thời điểm đánh giá độc tính Tách lấy não
Biểu hiện c-fos
(Phơi nhiễm 3-MCPD trong 24-48-72 giờ)
Nhuộm cresyl violet để phát hiện thoái hóa tế bào thần kinh (Phơi nhiễm 3-MCPD trong 24-48-
51
2.3.4.1. Phương pháp hóa mô miễn dịch biểu hiện c-fos
Chuẩn bị mẫu mô nhuộm:
- Chuột thí nghiệm được cho phơi nhiễm (uống) 3-MCPD ở các liều 10 mg/kg, 50 mg/kg và 100 mg/kg trong thời gian 24 giờ, 48 giờ và 72 giờ. Ngay sau đó, chuột được gây mê bằng thiopental (100 mg/kg, tiêm phúc mạc).
- Khi chuột đã mê, mở lồng ngực, dùng kim truyền ghim vào thất trái, cắt một vết nhỏ ở tĩnh mạch chủ phải và truyền dung dịch NaCl 0,9% để rửa sạch máu trong hệ tuần hoàn (cho đến khi gan chuyển thành màu vàng nhạt); sau đó truyền dung dịch paraformaldehyd (PFA) 4% để cố định mô.
- Tách lấy não chuột và ngâm trong dung dịch PFA qua đêm.
- Sau đó tiếp tục ngâm não chuột trong dung dịch sucrose 30% đến khi não chìm xuống (khoảng 2 ngày).
- Cắt não bằng máy cắt mô lạnh, độ dày lát cắt 25µm.
Quy trình nhuộm [78]:
- Rửa các lát cắt 3 lần với dung dịch đệm phosphat 0,1M, pH = 7,4. - Ngâm lát cắt 20 phút trong dung dịch hydrogen peroxid 0,3%. - Rửa 3 lần với dung dịch đệm phosphat 0,1M, pH = 7,4. - Ủ các lát cắt 20 phút trong dung dịch albumin bò 5%.
- Ủ các lát cắt với dung dịch kháng thể sơ cấp đa dòng kháng c-fos ly trích từ huyết thanh thỏ (hãng Sigma) qua đêm ở nhiệt độ 40C. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
- Rửa 3 lần với dung dịch đệm phosphat 0,1M.
- Ủ các lát cắt với dung dịch kháng thể thứ cấp liên kết với extravidin-peroxidase (hãng Sigma) khoảng 1 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Rửa 3 lần với dung dịch đệm phosphat 0,1M.
- Ủ các lát cắt với dung dịch kháng thể thứ cấp liên kết với extravidin-peroxidase (30 phút ở nhiệt độ phòng).
- Rửa 3 lần với dung dịch đệm phosphat 0,1M.
- Ngâm lát cắt 10 phút với dung dịch thuốc thử AEC (3-Amino-9-Ethyl- Carbazole) cho đến khi dung dịch có màu tím-hồng đến nâu.
52
- Đặt các lát cắt trên lam kính đã được phủ gelatin
- Quan sát mẫu bằng kính hiển vi dưới vật kính 4, 10 hay 40.
Sự biểu hiện c-fos được xem là dương tính khi trên mẫu mô có sự xuất hiện của các điểm bắt màu hồng-tím hay nâu.
Hình 2.5. Mẫu mô não được nhuộm hóa mô miễn dịch c-fos do Sigma minh họa trên tờ thông tin về sản phẩm (dấu mũi tên chỉ phản ứng dương tính của c-fos).
2.4.4.2. Đánh giá sự thoái hóa tế bào thần kinh bằng nhuộm cresyl violet
Chuẩn bị mẫu mô nhuộm:
- Xử lý và cắt lát mô não được tiến hành tương tự như phương pháp hóa mô miễn dịch.
53
Sơ đồ 2.5. Quy trình nhuộm cresyl violet
Mẫu lam đã nhuộm màu được quan sát dưới kính hiển vi để đánh giá sự thoái hóa tế bào thần kinh.
Đặt mẫu cắt mô lên lam kính đã được phủ bằng gelatin 3% Xylen I (1 phút) Xylen II (1 phút) Etanol 100% (1 phút) Etanol 95 % (1 phút) Etanol 85 % (1 phút) Xylen I (1 phút) Etanol 100% (1 phút) Etanol 95 % (1 phút) Etanol 85 % (1 phút) Mẫu đã nhuộm Xylen II (1 phút) Etanol 75 % (2 phút) Etanol 50 % (1 phút) Nước (1 phút)
Thuốc nhuộm cresyl violet ( 2 phút).
Nước (2 phút) Etanol 50 % (1 phút) Etanol 75 % (2 phút)
54
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU
3.1. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học
Khác với các nghiên cứu trước đây, quy trình đánh giá độc tính mạn tính của 3- MCPD trên huyết học trong nghiên cứu này được thiết kế ở 3 mức liều thấp hơn: 1 mg/kg, 10 mg/kg, 20 mg/kg và theo dõi trong thời gian dài hơn: 6 tháng và 12 tháng dựa trên ba chỉ tiêu là công thức máu, hình thái tế bào và thời gian đông cầm máu. Việc lựa chọn 3 mức liều trên nhằm mục đích theo dõi đáp ứng theo liều và căn cứ trên tài liệu cho thấy liều thấp nhất gây độc tính trên thú thử nghiệm của 3-MCPD là 1,1 mg/kg [97].
3.1.1. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên công thức máu
Các máy xét nghiệm huyết học được nội kiểm trên các thông số công thức máu trước khi đo mẫu. Chương trình nội kiểm được thực hiện theo đúng quy định của phòng xét nghiệm và tất cả các kết quả nội kiểm đều cho kết quả đạt yêu cầu. Như vậy, các thông số công thức máu đo trên các máy xét nghiệm huyết học là tin cậy.
3.1.1.1. Tác động của 3-MCPD trên công thức máu sau 6 tháng phơi nhiễm 3-
MCPD ở các liều 1 mg/kg, 10 mg/kg và 20 mg/kg
Trong thời gian thử nghiệm, một số chuột ở các lô thí nghiệm bị tử vong không rõ nguyên nhân. Ngoài ra, một số mẫu máu của lô chứng và của lô 3-MCPD bị đông trong quá trình lấy mẫu, vì thế bị loại bỏ. Các kết quả về công thức máu của những lô thí nghiệm được trình bày dưới đây. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
a. Tác động của 3-MCPD sau 6 tháng phơi nhiễm trên tổng lượng bạch cầu và
các loại bạch cầu
55
Bảng 3.1. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng Lô n (ban đầu) n (kết thúc) Số mẫu máu đạt Tổng lượng bạch cầu (x 103/mm3) Bạch cầu trung tính (x 103/mm3) Bạch cầu đơn nhân (x 103/mm3) Bạch cầu lympho (x 103/mm3) Chứng 20 18 15 12,85 ± 0,96 6,45 ± 0,78 0,86 ± 0,18 5,21 ± 0,54 3-MCPD 1 mg/kg 20 18 13 13,58 ± 1,08 4,86 ± 0,66 1,04 ± 0,28 7,57 ± 0,68* 3-MCPD 10 mg/kg 20 11 11 12 ± 1,28 3,42 ± 0,32** 0,48 ± 0,07 7,9 ± 1,04*** 3-MCPD 20 mg/kg 20 14 14 12,1 ± 1,17 3,68 ± 0,5** 0,54 ± 0,14 7,73 ± 0,84* *P < 0,05; ** P < 0,01; ***P < 0,001 so với lô chứng (phép kiểm t-Student)
Biểu đồ 3.1. Tác động của 3-MCPD trên các chỉ số bạch cầu ở các lô thử nghiệm độc tính mạn 6 tháng
56
Trên tổng lượng bạch cầu: không có sự khác biệt về tổng lượng bạch cầu giữa lô chứng so với các lô có sử dụng 3-MCPD. Như vậy, khi cho chuột uống liên tục 3- MCPD trong 6 tháng với các liều 1 mg/kg, 10 mg/kg và 20 mg/kg, 3-MCPD không làm thay đổi tổng lượng bạch cầu.
Trên bạch cầu trung tính: so với lô chứng, số lượng tế bào bạch cầu đa nhân trung tính ở các lô sử dụng 3-MCPD giảm từ 25-50%, trong đó số lượng bạch cầu đa nhân trung tính ở các lô 3-MCPD 10 mg/kg và 20 mg/kg giảm khoảng 50% và có ý nghĩa thống kê. Như vậy, sử dụng liên tục 3-MCPD trong thời gian dài với liều lượng từ 1 mg/kg-20 mg/kg có tác động làm giảm số lượng bạch cầu trung tính.
Trên bạch cầu đơn nhân:số lượng bạch cầu đơn nhân ở 2 lô 3-MCPD 10 mg/kg và 20 mg/kg có khuynh hướng giảm (p = 0,07) so với lô chứng, mặc dù về mặt thống kê chưa đạt ý nghĩa toán học. Kết quả này có thể cần thêm số liệu thí nghiệm để có thể kết luận về tác động của 3-MCPD.
Trên bạch cầu lympho: ngược lại với kết quả về số lượng bạch cầu trung tính và bạch cầu đơn nhân, 3-MCPD lại làm tăng số lượng bạch cầu lympho. So với lô chứng thì số lượng bạch cầu lympho ở các lô dùng 3-MCPD đều tăng khoảng 40%- 50% và có ý nghĩa thống kê.
Đối với 2 loại bạch cầu ưa kiềm và ưa acid, do không có sự khác biệt giữa lô chứng và các lô sử dụng 3-MCPD, hơn nữa do chiếm tỷ lệ rất thấp (bạch cầu ưa acid: 0%, bạch cầu ưa kiềm: 0,1%) trong kết quả xét nghiệm, vì thế chúng tôi không trình bày trong bảng và biểu đồ trên.
Như vậy, theo thiết kế trong thử nghiệm này, phơi nhiễm 3-MCPD trong 6 tháng ở liều 10 mg/kg và 20 mg/kg gây giảm số lượng bạch cầu trung tính, có khuynh hướng gây giảm bạch cầu đơn nhân và gây tăng bạch cầu lympho. Tác động gây suy giảm bạch cầu trung tính và gây tăng bạch cầu lympho của 3-MCPD sau 6 tháng phơi nhiễm, có thể do một trong những nguyên nhân sau [3],[5-6]:
- Do nhiễm virus: virus cúm, sởi, virus gây viêm gan.
- Giảm bạch cầu trung tính theo chu kỳ: chủ yếu do rối loạn về mặt di truyền. - U hạch, ung thư bạch cầu hay bệnh tự miễn.
57
Tuy nhiên, nguyên nhân thật sự của bất thường này chưa thể kết luận được. Kết quả này sẽ được phân tích sâu hơn sau khi có đủ dữ liệu về độc tính của 3-MCPD trên