1.9.1. Khái niệm
Có rất nhiều kỹ thuật nhuộm màu để phát hiện tế bào thần kinh. Trong lĩnh vực thần kinh, phương pháp hay sử dụng nhất là nhuộm màu mô thần kinh bằng cresyl violet. Nhiều chuyên gia mô học thần kinh cho rằng, phương pháp nhuộm màu này tốt hơn phương pháp sử dụng hematoxylin.
Cresyl violet là một chất hữu cơ, với công thức hóa học tổng quát là C19H18ClN3O. Cresyl violet được sử dụng trong sinh học và y học để nhuộm màu mô trong nghiên cứu về mô học. Cresyl violet có ái lực cao với RNA và DNA vì thế có thể được sử dụng để nhuộm nhân tế bào thần kinh. Bên cạnh đó, cresyl violet cũng nhuộm màu rất đặc hiệu lưới nội chất thô của tế bào (còn gọi là thể Nissl) (hình 1.7) [64].
Hình 1.7. Nhuộm cresyl violet quan sát thân tế bào thần kinh và thể Nissl
Ứng dụng của phương pháp nhuộm màu này giúp phát hiện sự thoái hóa tế bào thần kinh: nếu bị thoái hóa thì mô nhuộm có sự bắt màu không rõ cho từng thân tế bào với ranh giới rõ rệt. Nhân sẽ co cụm và tạo thành những mảng bắt màu tím-xanh không có ranh giới giữa các tế bào.
37
1.9.2. Các bước tiến hành
Phương pháp nhuộm cresyl violet thường bao gồm 3 bước sau: - Bước 1: Cắt lát não.
- Bước 2: Đặt các lát não lên lam kính và bắt đầu nhuộm.
- Bước 3: Quan sát các lát cắt đã được nhuộm kết hợp với một bản đồ (atlas) não. Nếu quan sát bằng kính hiển vi quang học thì lát cắt thường dày khoảng 50µm. Để làm được điều đó thì cần dùng một máy điều lạnh và thiết bị vi phẫu. Khi dùng thiết bị vi phẫu thì mẫu được làm đông lạnh bằng máy điều lạnh hoặc được nhúng parafin.
Kỹ thuật nhuộm gồm nhiều bước với những khoảng thời gian khác nhau nhưng chủ yếu nhằm những mục đích sau:
- Bước 1: nhúng trong cồn để loại chất béo và những hóa chất gây dính từ mô. - Bước 2: các lát cắt được nhúng ngập trong thuốc nhuộm.
- Bước 3: khử nước bằng cồn với nồng độ tăng dần.
- Bước 4: những phần không được nhuộm được làm trong suốt bằng các tác nhân làm sạch.
1.9.3. Quan sát
Có thể sử dụng một hộp đèn và một cái kính lúp hoặc kính hiển vi quang học dưới ánh sáng thấp, kiểm tra các mẫu nhuộm. Thân tế bào sẽ xuất hiện dưới dạng màu tím đến màu xanh đậm. Các bó sợi sẽ có màu trắng hoặc trong suốt. Dùng kính có độ phóng đại lớn hơn thì cũng có thể quan sát được một vài cơ quan dưới mức tế bào (thường là nhân tế bào). Nếu như các tế bào thần kinh bị thoái hóa thì sẽ thấy màu tím nhuộm đậm hơn vì các tế bào bị thoái hóa sẽ co cụm lại, ranh giới giữa các tế bào không rõ rệt [64].
38
CHƯƠNG 2
ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU