1.4.1. Đại cương
Thử nghiệm vi nhân giúp phát hiện các hóa chất có khả năng gây ra các tổn hại trên nhiễm sắc thể. Một “vi nhân” là một nhân nhỏ hình thành trong quá trình phân bào do sự phá vỡ nhiễm sắc thể [35],[43],[57],[87],[106].
Nhân là cơ quan trong tế bào có chứa vật liệu di truyền (DNA) định hướng các chức năng bình thường của tế bào và sự sinh sản tế bào. Trong tế bào của sinh vật, nhân chứa DNA nằm ngay trong nhiễm sắc thể. Hình dạng, kích thước và số lượng nhiễm sắc thể của một loài là hằng định. Trong suốt quá trình phân chia tế bào, vật liệu di truyền (nhiễm sắc thể) nhân đôi và sau đó phân chia đồng đều cho 2 tế bào con. Nếu quá trình bị gián đoạn, hoặc các nhiễm sắc thể bị phá hủy do hóa chất hay phóng xạ, thì sự phân phối vật liệu di truyền cho 2 nhân con trong suốt quá trình phân bào có thể bị ảnh hưởng và một phần hoặc toàn bộ nhiễm sắc thể có thể không hiện diện ở nhân của một trong hai tế bào con. Khi đó, vật liệu di truyền không được gắn kết
25
vào nhân mới mà chính nó có thể hình thành “vi nhân”, có thể dễ dàng nhìn thấy được dưới kính hiển vi. Vì vậy, trong thử nghiệm vi nhân, vật thí nghiệm được cho sử dụng một loại hóa chất và sau đó định lượng tần suất các tế bào có hình thành vi nhân ở một số thời điểm sau khi sử dụng. Nếu nhóm thú vật có sử dụng hóa chất thể hiện tần suất các tế bào có vi nhân cao hơn một cách có ý nghĩa so với nhóm chứng thì hóa chất sử dụng được cho là có khả năng gây ra sự hủy hoại cấu trúc và/hoặc sự biến đổi số lượng nhiễm sắc thể, và có thể gây độc tính trên gen.
Hình 1.2. Cơ chế tạo thành “vi nhân” do nhiễm sắc thể bị phá vỡ và không tích hợp được vào nhân trong quá trình phân chia tế bào và sự biểu hiện vi nhân trong hồng cầu. “Nguồn: Fenech M. và cộng sự (1999) [35].”
Việc định lượng khả năng hóa chất gây ra sự hủy hoại nhiễm sắc thể được quan tâm nhiều vì hầu hết các dạng ung thư được đặc trưng bởi sự thay đổi nhiễm sắc thể chuyên biệt cho từng loại bướu riêng biệt, và có thể là nguy cơ sinh ung thư, cũng có thể là nguy cơ gây ra sự hủy hoại các tế bào phôi, dẫn đến những trở ngại bất thường trong sinh sản.
Thử nghiệm vi nhân được thực hiện theo nhiều cách khác nhau, phụ thuộc vào các nhà nghiên cứu, sinh vật thử nghiệm, loại tế bào định lượng, và kiểu tác động của hóa chất. Thử nghiệm vi nhân thường được hướng dẫn thực hiện trên chuột nhắt hoặc chuột cống, các mô được đánh giá tần suất vi nhân thường là tủy xương và máu ngoại vi. Các xét nghiệm vi nhân phải được thực hiện trên các tế bào đang phân chia, trong đó hồng cầu là những tế bào thường được sử dụng để tìm sự hiện diện của vi nhân. Những hồng cầu trưởng thành trong máu ngoại biên được tạo ra
26
trong tủy xương từ các tế bào tiền hồng cầu. Tốc độ phân chia nhanh của các tế bào tiền hồng cầu khiến hồng cầu là loại tế bào lý tưởng cho thử nghiệm vi nhân. Một điểm khác biệt nữa của hồng cầu là trong quá trình phân chia tế bào, nhân bị đẩy ra khỏi tế bào ngay trước khi hình thành hồng cầu biệt hóa hoàn chỉnh; và vì thế hồng cầu đã biệt hóa không thể phân chia thêm nữa. Do đó, các tế bào gốc ở tủy xương liên tục tạo ra các tế bào hồng cầu mới để thay thế các tế bào chết đi. Nếu một hóa chất phá hủy một tế bào gốc gây ra sự hình thành một vi nhân, vi nhân này vẫn còn lại trong tế bào hồng cầu sau khi nhân chính bị đẩy ra ngoài và vì thế có thể quan sát dễ dàng dưới kính hiển vi [106].
1.4.2. Cách tiến hành thử nghiệm vi nhân
1.4.2.1. Thử nghiệm vi nhân đánh giá trên tế bào tủy xương
Thử nghiệm điển hình vi nhân hình thành trong tế bào ở tủy xương được thực hiện trên chuột nhắt hay chuột cống. Có từ 1 đến 3 nhóm được cho tiếp xúc với hóa chất, và thường có 5 thú vật giống đực trong mỗi nhóm. Liều sử dụng tăng dần cho đến khi đạt liều dung nạp tối đa. Đường tiếp xúc với hóa chất trong những thử nghiệm ngắn hạn này thường là tiêm phúc mô hoặc đường uống. Dựa trên chu kỳ tế bào và thời gian trưởng thành của các tế bào hồng cầu, tủy xương được lấy để xét nghiệm sau 24 giờ sau liều tiếp xúc cuối cùng; khoảng thời gian này gọi là thời gian lấy mẫu. Thời điểm đó, khoảng 50% các tế bào hồng cầu ở tủy xương chưa trưởng thành, là các tế bào mới được hình thành, và đây là các tế bào được kiểm tra sự hiện diện của vi nhân. Vật thử nghiệm được gây mê bằng CO2 để lấy ra mẫu xương đùi. Tủy xương được lấy ra khỏi xương đùi và trải đều lên lam kính. Lam kính phải sạch và khô, cố định, và được nhuộm với chất gắn chuyên biệt DNA phát huỳnh quang để dễ dàng phát hiện sự hiện diện của vi nhân [106].
1.4.2.2. Thử nghiệm vi nhân đánh giá trên máu ngoại vi
Thử nghiệm vi nhân được thực hiện trên chuột nhắt, mẫu máu được thu thập từ máu ngoại vi; lam kính được chuẩn bị, cố định và nhuộm giống như trong nghiên cứu ở tủy xương. Quan sát trên 1000 đến 10000 hồng cầu trưởng thành để ghi nhận sự hình thành vi nhân ở mỗi vật thử nghiệm. Những hồng cầu trưởng thành này chiếm
27
khoảng 95% hoặc hơn trong tổng số hồng cầu trong máu tuần hoàn. Tỷ lệ hồng cầu đa sắc được xác định để đo lường độc tính gây ra lên tủy xương bởi hóa chất. Tất cả dữ liệu được phân tích riêng biệt đối với chuột đực và chuột cái. Quy trình nhuộm cam acridin cho phép phân biệt các tế bào hồng cầu non, nhỏ hơn 24 giờ tuổi (hồng cầu đa sắc) và hồng cầu trưởng thành 2-35 ngày tuổi dựa trên đặc tính bắt màu nhuộm. Hồng cầu đa sắc có chứa phần RNA còn lại là điểm khác biệt với hồng cầu trưởng thành. Vi nhân ở hồng cầu đa sắc bắt nguồn từ sự phá hủy trong khoảng thời gian 48 giờ, trong khi ở hồng cầu trưởng thành là sự tích lũy trong vòng một tháng với tổng số hồng cầu trưởng thành đạt trạng thái cân bằng trong máu ngoại biên (tỷ lệ ngang nhau giữa số lượng hồng cầu mới bị phá hủy hay không bị phá hủy đi vào máu từ tủy xương và số lượng hồng cầu trưởng thành đi khỏi dòng máu). Vì vậy, đối với nghiên cứu vi nhân trong máu ngoại vi trong thời gian dài, việc ghi nhận tần suất vi nhân ở hồng cầu trưởng thành thường thích hợp hơn. Lách của chuột nhắt thiếu khả năng loại bỏ các hồng cầu bị hủy hoại khỏi máu tuần hoàn, trong khi lách của chuột cống lại loại bỏ rất nhanh các hồng cầu có vi nhân khỏi tuần hoàn. Vì thế, chỉ có chuột nhắt được chọn cho thử nghiệm vi nhân trong thời gian dài và việc đánh giá được dựa trên hồng cầu trưởng thành. Trong nghiên cứu cấp tính, mẫu tủy xương được phân tích dựa trên các hồng cầu đa sắc [106].
Gần đây, người ta đã sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào để phân tích hồng cầu ngoại biên để ghi nhận tần suất xuất hiện vi nhân. Trong nghiên cứu độc tính kéo dài 13 tuần sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào, mẫu máu được thu thập trong vòng 24 giờ sau liều cuối cùng. Mẫu máu chống đông bằng heparin được cố định với methanol lạnh và phân tích tần suất hồng cầu có vi nhân bằng cách sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào, cả hồng cầu trưởng thành và hồng cầu non đều được phân tích riêng bằng cách sử dụng chất đánh dấu bề mặt tế bào chuyên biệt để phân biệt 2 loại tế bào này. Do kỹ thuật này đánh giá dựa trên các tế bào mục tiêu là hồng cầu non, nên mẫu máu dùng phân tích thu thập trong vòng 24-48 giờ, trước khi lách làm thay đổi tỉ lệ hồng cầu lưới có vi nhân trong máu tuần hoàn. Vì vậy, việc sử dụng phương pháp phân tích dòng chảy tế bào
28
cho phép đánh giá sự tạo thành vi nhân sử dụng mẫu máu thay vì phải tiến hành trên tủy xương[106].
1.5. GIẢI PHẪU MÔ HỌC - DỊ SẢN TẾ BÀO GAN
Định nghĩa
Dị sản tế bào gan được định nghĩa như là sự tăng trưởng hay nhân rộng các tế bào, nhân đa hình, đa nhân, xảy ra ở từng vùng hoặc toàn bộ gan cùng với các nốt xơ gan. Sự nhân rộng này bao gồm cả nhân và bào tương và thường tăng lên gấp 2-3 lần so với bình thường và sự gia tăng số lượng tế bào Kupffer. Tỉ lệ nhân và bào tương thì bình thường. Những chất bên trong nhân có thể được nhìn thấy và hạch nhân to lên (lồi ra). Tuy nhiên, ý nghĩa của sự xuất hiện những tế bào và nhân lớn trên tiêu bản mô nên được đánh giá cẩn thận vì tế bào lớn còn có thể gặp trong nhiều trường hợp khác, thậm chí đó là vấn đề sinh lý bình thường gặp trong hiện tượng lão hóa. Mặt khác, sự kiểm tra cẩn thận đôi khi phát hiện sự tăng sản rõ rệt của những tế bào gan nhỏ thay vì là các tế bào gan lớn ở các gan bị xơ hóa kèm theo ung thư tế bào gan [30].
Sắc tố bào tương bình thường mặc dù thỉnh thoảng có sự tăng hoặc giảm glycogen so với các vùng gan xung quanh không bị dị sản. Những giọt dịch mật nhỏ bên trong tế bào chất đôi khi được nhìn thấy khi có dấu hiệu tắc nghẽn ống mật. Những mảng tế bào gan không đều nhưng vẫn giữ nguyên mạng lưới và sự sắp xếp theo dạng hình sin bình thường. Những thay đổi này xuất hiện, nhân rộng và xảy ra trong nhóm tế bào gan hoặc ảnh hưởng đến toàn bộ nốt xơ gan và sự xuất hiện đó đủ lớn để có thể nhìn thấy khi phóng đại ở tỉ lệ thấp [11].
Phân loại
Dị sản tế bào gan có thể chia thành hai dạng: dị sản tế bào gan nhỏ (SLCD – Small Liver Cell Dysplasia) và dị sản tế bào gan lớn (LLCD – Large Liver Cell Dysplasia) hay còn gọi là thay đổi tế bào gan lớn (LLCC – Large Liver Cell Change) [11],[61],[95].
Dị sản tế bào gan nhỏ: hay còn gọi là thay đổi tế bào gan nhỏ, được đề cập lần đầu vào năm 1983 bởi Watanabe, là tổn thương được đặc trưng bởi những nhóm tế
29
bào gan dày đặc với tỉ lệ nhân/bào tương lớn [101].
Hình 1.3. Vi thể dị sản gan với nhân đa hình, nhân đôi và màng nhân bất thường [30]
Thay đổi tế bào gan lớn:là một tổn thương đặc biệt tìm thấy trong viêm gan mạn tính hoặc xơ gan, và xuất hiện do sự nhân rộng tế bào gan và nhân đa hình với nhiều nhiễm sắc thể và nhiều nhân [25],[76]. Tiếp theo định nghĩa này, một số nghiên cứu đã được thực hiện và thống nhất rằng về thực tế có thể xem thay đổi tế bào gan lớn là một nhóm tế bào gan to lên, có thể nhận biết được bởi vì chúng to hơn bình thường, kèm theo là nhân có nhiều nhiễm sắc thể và đa hình, hạch nhân lồi lên. Tế bào có hai nhân chiếm đa số so với các tế bào có nhiều nhân [95].
Dưới kính hiển vi điện tử, tế bào gan lớn đã bị thoái hóa và có một số dấu hiệu của tế bào tái sinh. Có sự phân phối lại các tiêu điểm phát sinh thay đổi. Tình trạng dị sản này tồn tại theo thời gian, nhưng tổn thương của nó không thế dẫn tới tử vong nếu không chuyển thành tế bào ác tính [77].
Tuy nhiên thay đổi tế bào gan lớn là dấu hiệu tiên lượng của ung thư biểu mô tế bào gan với nguy cơ tiến triển thành dạng ung thư này cao gấp 5 lần so với bình thường. Thay đổi tế bào gan lớn có giá trị tiên lượng cho ung thư biểu mô tế bào gan đạt tới 82-97% [76].
Thay đổi tế bào gan lớn thường được phát hiện trong những nhóm tế bào dị sản phát triển trong xơ gan, đặc biệt với xơ gan mức độ cao. Trong hàng loạt những nhóm tế bào gan trong xơ gan, Borzio và cộng sự tìm thấy có sự thay đổi tế bào gan lớn trong nhiều khối u nhỏ (chiếm 64% các thương tổn phát hiện được) và sau đó sẽ
30
chuyển sang dạng ác tính. Chỉ có khoảng 19% thay đổi tế bào gan lớn trong các thương tổn sẽ duy trì ở trạng thái ổn định (không chuyển sang dạng ác tính). Thay đổi tế bào gan lớn xuất hiện liền kề với những nốt dị sản mức độ cao sẽ làm tăng nguy cơ chuyển sang dạng ác tính gấp 9 lần [76].
Một số tác giả đề xuất rằng thay đổi tế bào gan lớn nên được xem là giai đoạn tiền ác tính (căn cứ trên sinh bệnh học, cấu trúc DNA và giá trị tiên đoán). Một số tác giả khác cho rằng thay đổi tế bào gan lớn là một tiến trình tái sinh chủ động do các thương tổn mạn tính (tổn thương do virus, hiện tượng ứ mật) hoặc do sự lão hóa (sự tạo thể đa bội của những tế bào gan bất thường nhưng cuối cùng được biệt hóa), hoặc cả hai. Tuy nhiên, cả hai trường phái đều thống nhất rằng thay đổi tế bào gan lớn là một tổn thương không điển hình về mặt hình thái học và kết hợp với nguy cơ ác tính tăng cao. Khi nghiên cứu trên người, Lee và cộng sự đã đưa ra giả thuyết rằng thay đổi tế bào gan lớn có liên quan đến nguy cơ phát sinh ung thư biểu mô tế bào gan nhưng đây không phải là điều kiện tiên quyết [76].
Yếu tố nguy cơ của thay đổi tế bào gan lớn: các yếu tố nguy cơ của thay đổi tế bào gan lớn gồm: độ tuổi (nguy cơ tăng khi trên 50 tuổi), nam giới, thời gian prothombin giảm dưới 70%, alfa-fetoprotein (AFP) huyết thanh > 15 ng/L và giãn tĩnh mạch rộng. Đây là nhóm yếu tố nguy cơ cao, và xác suất sẽ tiến triển thành ung thư biểu mô gan trong vòng ba năm là 24% [11],[76].
Tỷ lệ mắc và nguyên nhân của thay đổi tế bào gan lớn
Trong một nghiên cứu trên 552 bệnh nhân ở Châu Phi, thay đổi tế bào gan lớn được tìm thấy trong 1% trường hợp có gan bình thường, 7% bệnh nhân ung thư biểu mô gan, 19% bệnh nhân xơ gan, 63% bệnh nhân xơ gan và ung thư tế bào gan [15]. Liên quan tới bệnh viêm gan virus, tỷ lệ xuất hiện thay đổi tế bào gan lớn trong viêm gan C mạn tính do virus là 6-28%, trong viêm gan B mạn tính do virus là 13- 32%, nghiên cứu chủ yếu dựa trên sinh thiết gan. Tỷ lệ này trong trường hợp xơ gan lại cao hơn. Tỷ lệ xuất hiện thay đổi tế bào gan lớn trong xơ gan siêu vi C là 71- 85%, xơ gan siêu vi B là 100%.
31
virus (50% các bệnh viêm gan tự miễn, 52-74% xơ gan do rượu). Nó cũng được tìm thấy trong các trường hợp bệnh khác ở trẻ em, như bệnh tăng tyrosin huyết di truyền, bất sản mật, viêm gan sơ sinh tự phát, sắt lưu trữ ở trẻ sơ sinh [11].
1.6. GEN TIỀN UNG THƯ C-FOS (PROTO-ONCOGEN)
C-fos là một gen tiền ung thư (proto-oncogen). Các gen tiền ung thư mã hóa cho các protein giúp điều hòa sự tăng trưởng và biệt hóa của tế bào. Khi các gen tiền ung thư này bị đột biến hoặc được biểu hiện quá mức, nó có thể chuyển thành các gen sinh ung thư (oncogene) và gây rối loạn quá trình tăng trưởng hoặc biệt hóa [40]. C- fos thuộc họ các gen biểu hiện sớm của các yếu tố sao chép. Sự tăng sao chép và tăng biểu hiện c-fos xảy ra khi có sự kích thích của các yếu tố tăng trưởng. Trong hệ thần kinh trung ương, c-fos là chất đánh dấu trực tiếp hoạt động của thần kinh vì thế sự biểu hiện c-fos trong não đôi khi lại phản ánh hoạt động của thần kinh chứ không