Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học ở các pha cấp tính, bán cấp tính và mạn tính được tiến hành như sau:
Bước 1: cho chuột thử nghiệm uống 3-MCPD hàng ngày với liều từ 1 mg/kg đến 100 mg/kg trong các khoảng thời gian tương ứng với các pha cấp tính (24-48-72 giờ và 2 tuần), bán cấp tính (3 tháng) và mạn tính (6 tháng, 12 tháng).
Bước 2: đánh giá độc tính của 3-MCPD qua các thông số công thức máu, hình thái tế bào và thời gian đông cầm máu.
Tóm tắt quy trình thử nghiệm đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học được mô tả trong sơ đồ 2.1.
42
Sơ đồ 2.1. Thiết kế quy trình đánh giá độc tính của 3-MCPD trên huyết học
2.3.1.1. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên công thức máu
Chuột được phân chia thành các lô chứng và lô uống 3-MCPD, mỗi lô 20 con như sau:
Thời gian phơi nhiễm Dịch uống Lô chứng Lô thử
6 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày 20 mg/kg/ngày 12 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày
Gây phơi nhiễm 3-MCPD
Chuột thử nghiệm
Đạt thời điểm đánh giá độc tính
Gây mê chuột
Lấy máu toàn phần
Đánh giá độc tính trên huyết học
Công thức máu Hình thái Đông cầm máu
Hồng cầu và các chỉ số liên quan Bạch cầu và các chỉ số liên quan Tiểu cầu và các chỉ số liên quan Hồng cầu Bạch cầu Thời gian đông máu Thời gian cầm máu Tổng hợp kết quả về độc tính
43
Sau thời gian phơi nhiễm 3-MCPD, chuột được lấy máu toàn phần để đánh giá độc tính mạn tính (6 tháng và 12 tháng) của 3-MCPD trên công thức máu thông qua các chỉ số huyết học sau:
Số lượng hồng cầu và các chỉ số liên quan như: hemoglobin (Hb), hematocrit (Hct), thể tích trung bình hồng cầu (MCV), lượng huyết sắc tố trung bình trong hồng cầu (MCH) và nồng độ huyết sắc tố trung bình trong hồng cầu.
Tổng lượng bạch cầu, bạch cầu trung tính, bạch cầu đơn nhân, bạch cầu lympho.
Số lượng tiểu cầu và thể tích trung bình tiểu cầu.
Cách lấy máu toàn phần đánh giá công thức máu:
Các mẫu máu được lấy từ tim chuột sau khi đã gây mê bằng đá CO2 với thể tích khoảng 0,75 - 1 ml/mẫu và chứa trong các ống nhựa chuyên dụng có EDTA để chống đông máu (được cung cấp bởi bệnh viện Chợ Rẫy).
Hình 2.4. Lấy máu từ tim chuột
2.3.1.2. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên hình thái tế bào
Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên hình thái hồng cầu
Trong nghiên cứu này, độc tính của 3-MCPD trên hình thái hồng cầu được đánh giá ở pha cấp tính (24, 48, 72 giờ và 2 tuần), bán cấp tính (3 tháng) và mạn tính (6 tháng, 12 tháng). Chuột thí nghiệm được phân thành các lô chứng và lô thử (uống 3- MCPD), 6-20 con/lô với thời gian phơi nhiễm như sau:
44
Thời gian phơi nhiễm Dịch uống Lô chứng Lô thử (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
24 giờ, 48 giờ, 72 giờ, 2 tuần Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày; 100 mg/kg/ngày 3 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày 6 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày; 40 mg/kg/ngày 12 tháng Nước x 3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày
Sau thời gian phơi nhiễm, hình thái hồng cầu được quan sát trên kính hiển vi bằng kỹ thuật phết máu ngoại vi. Riêng ở pha mạn tính 12 tháng, các chỉ số bất thường của hình thái hồng cầu trong mẫu máu toàn phần được khảo sát trên máy xét nghiệm huyết học ADVIA 2120i của hãng SIEMENS, Mỹ, bệnh viện Chợ Rẫy.
Kỹ thuật phết máu ngoại vi được thực hiện theo quy trình tóm tắt như sau: - 50 μl máu được lấy từ tĩnh mạch đuôi chuột sau khi làm sạch đuôi và vô trùng
bằng cồn 95%. Dùng kim 21G để chích vào tĩnh mạch đuôi chuột (cách chóp đuôi 5 cm)
- Cho 50 μl máu lấy được lên 2/3 lam kính, đặt lam kính lên bàn thí nghiệm và dùng cạnh của 1 lam kính khác kéo máu lên theo một góc 45o.
- Để khô tự nhiên, sau đó cố định bằng methanol trong khoảng 1 phút. - Nhuộm màu bằng thuốc thử Giemsa trong 30 phút.
Sau khi nhuộm, rửa lam kính bằng nước rồi để khô. Quan sát hình thái hồng cầu trên kính hiển vi dưới vật kính 10, 100 và so với lô chứng để tìm những khác biệt có ý nghĩa [106].
Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên hình thái bạch cầu
Độc tính của 3-MCPD trên hình thái bạch cầu được đánh giá ở pha mạn tính (phơi nhiễm 12 tháng) với phương pháp lấy máu toàn phần tương tự như đánh giá trên
45
hình thái hồng cầu ở pha mạn tính.
2.3.1.3. Đánh giá độc tính của 3-MCPD trên quá trình đông máu – cầm máu
Quá trình đông-cầm máu là sự tác động lẫn nhau giữa ba thành phần cơ bản: thành mạch máu, tế bào máu và các protein huyết tương dưới hình thức các phản ứng enzym. Các xét nghiệm đông cầm máu bao gồm thăm dò giai đoạn cầm máu ban đầu hay giai đoạn đông máu huyết tương (đông máu ngoại sinh hay nội sinh). Trong điều kiện cho phép thực tế, chúng tôi đánh giá độc tính bán cấp tính và mạn tính của 3-MCPD lên quá trình đông cầm máu ở giai đoạn cầm máu ban đầu thông qua khảo sát thời gian chảy máu và thời gian đông máu được tiến hành trong thời gian 3 tháng, 6 tháng và 12 tháng. Chuột thí nghiệm được chia thành các lô chứng và lô thử (uống 3-MCPD), mỗi lô 25 con với thời gian phơi nhiễm như sau:
Thời gian phơi nhiễm Dịch uống Lô chứng Lô thử
3 tháng, 6 tháng, 12 tháng
Nước x
3-MCPD 1 mg/kg/ngày; 10 mg/kg/ngày;
40 mg/kg/ngày
Phương pháp khảo sát thời gian chảy máu:
Cầm chuột bằng cách nắm giữ phần da đầu và da lưng chuột, tránh tác động vào đuôi chuột. Dùng kéo sắc cắt một đoạn đuôi dài khoảng 0,5 mm tính từ đầu mút ngoài. Ngâm ngay phần đuôi còn lại vào một cốc nước muối NaCl ấm 370C có nống độ 0.15M. Tính thời gian từ lúc máu bắt đầu chảy đến khi máu ngừng chảy [68].
Phương pháp khảo sát thời gian đông máu:
Hứng một giọt máu từ đuôi chuột lên lam kính được đặt trong hộp petri để tránh tác động của các yếu tố ảnh hưởng, đường kính giọt máu khoảng 6 – 7 mm. Theo dõi thời gian từ lúc lấy giọt máu ra lam kính đến khi giọt máu đông hoàn toàn [2],[7]. Các thông số của quá trình đông máu (thời gian chảy máu, thời gian đông máu) đều được ghi nhận và đưa vào kết quả thực nghiệm để xem xét và bàn luận.