PHƯƠNG TIỆN VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

2.2.1. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU

Thiết kế nghiên cứu: Nghiên cứu cơ bản, tiền cứu, mô tả, phân tích. 2.2.2. NỘI DUNG NGHIÊN CỨU

2.2.2.1. KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG CỦA UTNBVM

- Phương tiện nghiên cứu:

 Đèn pin.

 Đèn khe.

 Đèn soi đáy mắt trực tiếp.

 Đèn soi đáy mắt hình đảo.

 Nhãn áp kế Maklakov.

- Các biến số nghiên cứu:

* Về dịch tễ học lâm sàng: Hỏi và ghi nhận các thông tin vào bệnh án nghiên cứu:

 Giới tính nam/nữ.

 Dân tộc.

 Địa dư.

 Tiền căn dị tật bẩm sinh.

 Bị một mắt hay hai mắt.

 Thời gian từ lúc phát bệnh đến khi được xác định bệnh.

 Tuổi bệnh nhi lúc khám và tuổi phát bệnh.

 Tuổi cha/mẹ bệnh nhi.

 Số lượng và tuổi anh/chị/em ruột của bệnh nhi.

* Về thực thể lâm sàng:

Khám và ghi nhận các biểu hiện lâm sàng:

 Đồng tử trắng.

 Lác mắt.

Khám và ghi nhận các biến chứng:

 Phù giác mạc.

 Máu, mủ tiền phòng.

 Xuất huyết thể pha lê.

 Phình củng mạc.

 Lồi mắt.

 Rung giật nhãn cầu. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Sụp mi.

 Bong võng mạc.

 Viêm nội nhãn.

 Gieo rắc thể pha lê.

 Viêm mô hốc mắt.

 Tăng nhãn áp.

 Dấu hiệu di căn.

Ghi nhận các đặc điểm u:

 Vị trí u: trước xích đạo/ sau xích đạo + không rõ.

 Kích thước: lớn hơn, bằng, hay nhỏ hơn ½ thể tích nhãn cầu.

 Phân độ bệnh:

 Theo Reese-Ellsworth.

 Theo A, B, C, D, E, F.

2.2.2.2. KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM CẬN LÂM SÀNG CỦA UTNBVM - Đặc điểm và giá trị chẩn đoán UTNBVM của siêu âm

* Địa điểm: Bệnh viện Mắt Tp. HCM, Trung tâm Medic Tp. HCM. * Phương tiện nghiên cứu:

 Máy siêu âm A-B trắng đen hiệu Alcon, TX 76134.

 Máy siêu âm màu hiệu Toshiba Nemio, do Nhật sản xuất.

* Các biến số nghiên cứu

 Hình ảnh u trên võng mạc: có/không có hình ảnh khối u xuất phát từ võng mạc.

 Kích thước u: nhỏ hơn hay lớn hơn ½ nhãn cầu đo được qua thước đo đường kính các mặt cắt khối u trên siêu âm trắng đen.

 Vị trí u: trước hay sau xích đạo nhãn cầu + không rõ.

 Hình ảnh canxi hóa trong khối u qua siêu âm trắng đen.

 Sự hiện diện mạch máu của u qua siêu âm màu.

 Sự xâm lấn củng mạc: sự mất liên tục của thành củng mạc thấy

được qua siêu âm trắng đen.

 Dấu hiệu bong võng mạc.

 Số lượng u: xác định 1 u hay nhiều u.

Tất cả các biến số này là biến nhị giá: có/không.

- Đặc điểm và giá trị chẩn đoán UTNBVM của CT

* Địa điểm: Bệnh viện Mắt Tp. HCM, TT Medic Tp. HCM. * Phương tiện nghiên cứu: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Máy CT W3000, hiệu Hitachi, Nhật Bản sản xuất đặt tại bệnh

 Máy CT MSCT Aquilion đặt tại Trung tâm Medic Tp. HCM. * Các biến số nghiên cứu

 Hình ảnh u võng mạc: có/không có hình ảnh khối u xuất phát từ

võng mạc.

 Kích thước u: nhỏ hơn hay lớn hơn ½ nhãn cầu đo được qua thước đo đường kính các mặt cắt khối u trên CT.

 Vị trí u: trước hay sau xích đạo nhãn cầu + không rõ.

 Số lượng u: xác định là một khối u hay nhiều khối u (≥ 2 khối u).

 Hiện tượng canxi hóa trong khối u thấy được qua hình ảnh CT.

 Xâm lấn thành nhãn cầu: sự mất liên tục thành củng mạc thấy

được qua hình ảnh CT

 Dấu hiệu bong võng mạc.

 Xâm lấn dây thần kinh thị: là dấu hiệu dây thần kinh thị to hơn khi so sánh với dây thần kinh thị bên đối diện qua hình ảnh CT.

 Hình ảnh di căn não.

Các biến số này cũng được chia dưới dạng nhị giá: có/không.

- Khảo sát các đặc điểm và giá trị chẩn đoán UTNBVM của giải phẫu bệnh:

* Địa điểm: Bệnh viện Mắt Tp. HCM, Khoa Giải Phẫu Bệnh Bệnh viện Chợ Rẫy Tp. HCM, Bộ môn Giải Phẫu Bệnh Đại học Y Dược Tp. HCM.

* Qui trình:

 Tại bệnh viện Mắt Tp. HCM:

- Cắt rời dây thần kinh thị, đo chiều dài và đường kính bằng compas.

- Chọc hút dịch tiền phòng, làm 4 lam phết, cố định bằng cồn 90 độ. - Cắt rời giác mạc quanh vùng rìa giác mạc.

- Cắt đôi giác mạc qua vùng trung tâm để được 2 mảnh giác mạc gần bằng nhau.

- Ngâm 2 mảnh giác mạc vào 2 lọ riêng có formol 10%.

- Gởi 1 mẫu giác mạc và 2 phết tế bào về Khoa Giải Phẫu Bệnh Bệnh viện Chợ Rẫy, 1 mẫu giác mạc và 2 phết tế bào về Bộ môn Giải phẫu bệnh Đại học Y Dược Tp. HCM.

- Bổ đôi nhãn cầu quan sát dưới kính vi phẫu: sự xâm lấn thành nhãn cầu và dây thần kinh thị, kích thước, màu sắc, vị trí và số lượng khối u.

- Gởi mẫu u bệnh phẩm về Khoa Giải Phẫu bệnh Bệnh viện Chợ Rẫy và Bộ môn Giải Phẫu bệnh Đại học Y Dược Tp. HCM.

- Khảo sát sự di căn hốc mắt.

 Tại Bộ môn Giải phẫu Bệnh ĐHYD Tp. HCM và Khoa Giải

Phẫu Bệnh - BV Chợ Rẫy Tp. HCM sẽ khảo sát đại thể và vi thể với các biến số như sau:

- Các biến số khảo sát đại thể (bằng kính hiển vi phẫu thuật )

 Khối u võng mạc: có/không (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 Vị trí u: trước/sau xích đạo + không rõ.

 Số lượng u: một/nhiều

 Thể pha lê: gieo rắc/không

 Dây thần kinh thị: đường kính day thần kinh thị đoạn ra khỏi nhãn cầu

 Củng mạc: có/không mất liên tục thành củng mạc qua đại thể.

- Các biến số khảo sát vi thể: *Tế bào u.

* Hình hoa hồng(Flexner-Wintersteine Homer Wright rosttes ). * Dấu hiệu xâm lấn: tìm tế bào u ở:

 Giác mạc

 Tiền phòng

 Hắc mạc, củng mạc

 Dây thần kinh thị

Các biến số này cũng được chia dưới dạng biến nhị giá: có/không.

Hình 2. 27. Phết tế bào dịch tiền phòng.

Hình 2. 28. Cắt đôi giác mạc.

2.2.2.3. KHẢO SÁT CÁC ĐẶC ĐIỂM DI TRUYỀN CỦA UTNBVM

- Khảo sát các đặc điểm của bệnh sử di truyền, dịch tễ di truyền và lâm sàng di truyền của UTNBVM

Các biến số nghiên cứu: biến nhị giá (có/không)

* Bệnh sử gia đình: xác định các đối tượng cha, mẹ, anh, chị em ruột của bệnh nhi đã được chẩn đoán xác định UTNBVM đưa vào nghiên cứu có bị UTNBVM, đã chết do UTNBVM.

* Một u/nhiều u: một u khi chỉ có hình ảnh một khối u duy nhất ở nhãn cầu qua khám lâm sàng, đại thể, siêu âm và CT. Nhiều u là hình ảnh nhiều khối u, với ranh giới rõ qua khám lâm sàng, đại thể, siêu âm và CT.

* Phân loại bệnh

 Theo các đặc điểm bệnh sử di truyền, dịch tễ di truyền và lâm

sàng di truyền với tần suất nguy cơ thực tế.

 Theo cơ chế di truyền.

- Lập cây gia hệ các trường hợp UTNBVM có bệnh sử gia đình * Dựa vào các ký hiệu qui định chuẩn.

* Có mô tả các đặc điểm lâm sàng, di truyền tế bào và di truyền phân tử. - Khảo sát các đặc điểm di truyền tế bào của UTNBVM

* Địa điểm: Bộ môn Mô-Phôi-Di truyền - Đại học Y Dược Tp. HCM. * Đối tượng: Máu ngoại biên của 61 bệnh nhi UTNBVM và cha mẹ bệnh nhi.

* Mục tiêu: Lập nhiễm sắc thể đồ tìm bất thường ở NST13 và xác định các dạng tổn thương:  Mất đoạn  Thừa đoạn  Chuyển đoạn  Đảo đoạn * Qui trình thực hiện:

 Nuôi cấy: trong điều kiện vô trùng tuyệt đối.

+ Cho 0,3ml máu vào ống nghiệm có 5ml môi trường nuôi cấy, ghi số mẫu, ủ trong tủ nuôi cấy ở nhiệt độ 370C trong 72 giờ.

+ Sau 72 giờ, cho 0,1ml Colchicine 0,004% vào mỗi ống nghiệm, tiếp tục ủ ở 370C trong 1 giờ. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

+ Lấy ống nghiệm ra, cho quay li tâm vận tốc 1.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó hút bỏ phần dịch bên trên, để lại cặn lắng có tế bào. + Sốc nhược trương làm vỡ màng tế bào bằng 10ml dung dịch KCl 0,75M được ủ ở 370C cho mỗi ống, tiếp tục để ở 370C trong 30 phút. + Quay li tâm vận tốc 1.000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó hút bỏ phần dịch bên trên, để lại phần lắng xác tế bào.

+ Cho 10ml dung dịch cố định Carnoy (1 acid acetic + 3 methanol) để lạnh ở 40C trong tủ lạnh 20 phút.

+ Quay li tâm vận tốc 1.000 vòng/phút trong 5 phút, sau đó hút bỏ phần dịch bên trên, để lại phần cặn.

+ Tiếp tục thực hiện với dung dịch Carnoy, quay li tâm hút bỏ phần dịch bên trên, chừa lại phần cặn cho đến khi thấy dịch trong.

+ Trải cặn lên trên phiến kính lạnh (cho giọt dung dịch rơi từ độ cao khoảng 1m xuống phiến kính). Ghi số mẫu lên phiến kính phù hợp với số mẫu trên ống nghiệm.

 Nhuộm băng theo kỹ thuật nhuộm băng G:

+ Nhúng phiến kính vào dung dịch NaCl 0,15N, sau đó trypsin hóa bằng dung dịch trypsin 1:25 trong 10 giây.

+ Rửa qua NaCl và nhuộm 10-15 phút với thuốc nhuộm Giemsa ở pH 6,8.

+ Đọc kết quả với kính hiển vi Olympus BX60 và phân tích bằng phần mềm Cytovision 2.002.

+ Mỗi mẫu máu phải có 4 phiến kính.

+ Mỗi phiến kính sau nhuộm được khảo sát xác định số lượng tế bào đang phân chia, sau đó khảo sát định lượng ít nhất 10 phân bào ghi tọa độ nơi quan sát. Đếm số lượng NST của các phân bào và dùng phần mềm tin học tìm kiếm bất thường NST.

 Ghi mã file, chụp hình, in ra bằng máy in trên giấy trả lời kết quả di truyền của bộ môn Mô-Phôi-Di truyền.

Hình 2.29. Thông tin di truyền ở mức độ NST (ở kỳ giữa/ M - hình C) “Nguồn Mô học-quyển 1[9]”.

Hình 2.30. Mẫu nhiễm sắc thể đồ bình thường “Nguồn Molicular Biology in Cancer Medicin[34].

- Khảo sát đặc điểm di truyền phân tử của UTNBVM * Địa điểm:

+ Bệnh viện Mắt Tp. HCM.

+ Trung tâm Ung thư Singapore. Địa chỉ : 11 Hospital Drive . Singapore 169610.

* Người thực hiện: BS. Nguyễn Thị Thanh Tuyền: cựu BS củaTrung tâm

ung thư quốc gia Singapore.

* Đối tượng nghiên cứu: 14 mẫu u của bệnh nhi:

 3 ca UTNBVM 2 mắt (2 ca có bệnh sử gia đình, 1 ca tổn thương NST Del13q14).

 3 ca UTNBVM 1 mắt + nhiều u (1 ca có bệnh sử gia đình, 1 ca

 8 ca UTNBVM 1 mắt + 1 u (8 ca không có bệnh sử gia đình).

* Mục tiêu: khảo sát protein của gen RB1 (pRb107, pRb110, pRb130) ở u.

* Qui trình thực hiện:

 Lấy mẫu u: lấy mẫu cỡ 2 x 2 mm, giữ ẩm trong dung dịch NaCl, giữ lạnh

ở -810C.

 Gởi mẫu u: cho Labo Cancer Center ở Singapore.

 Qui trình thử nghiệm Western blot: Ly giải mẫu mô bằng dung môi và

thu lấy protein bằng ly tâm  đổ sang giếng có tiếp xúc giấy cellulose (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

 chạy điện 180V trong 6 giờ  chuyển protein sang giấy cellulose  cho protein gắn kết với 3 loại kháng thể chuyên biệt với các protein Prb 130, pRb110 và pRb 107 (kháng thể 1: kháng thể kết gắn chuyên biệt

với các protein của gen RB  sau đó dùng kháng thể 2 (kháng thể làm

hiện ảnh của kháng thể 1 và các protein) có gắn phóng xạ làm hiện hình protein với các kháng thể 1  tiến hành tự ghi ảnh phóng xạ.

Hình 2.32. Lấy mẫu u cho xét nghiệm Western blot

2.2.2.4. TƯ VẤN VÀ THỰC HIỆN TÀI LIỆU TUYÊN TRUYỀN VỀ UTNBVM

- Mục tiêu:

Phát hiện sớm, chẩn đoán sớm UTNBVM trong những năm tới ở các tỉnh phía Nam Việt Nam

- Đối tượng tư vấn:

Cha mẹ và thân nhân bệnh nhi bị UTNBVM. Các đối tượng có nguy cơ bị UTNBVM. - Đối tượng tuyên truyền:

Cộng đồng, đặc biệt là gia đình thân nhân bệnh nhi bị UTNBVM và các cơ sở y tế chăm sóc ban đầu, các bác sĩ nhi khoa, sản khoa.

- Nội dung tư vấn và tuyên truyền:

Nội dung tư vấn di truyền và tuyên truyền rút ra từ các kết quả nghiên cứu:

* Các nguyên nhân đưa con đến muộn. * Các biểu hiện thường gặp ở UTNBM.

* Tần suất nguy cơ thực tế của UTNBVM.

* Các đối tượng có nguy cơ UTNBVM cần được khám sàng lọc.

* Tình hình chẩn đoán, điềâu trị, và tiên lượng của UTNBVM hiện nay ở Việt Nam và thế giới.

* Phương pháp giáo dục sức khỏe: + Phát tài liệu cho các đối tượng.

+ Thuyết trình định kỳ ở các trung tâm truyền thông giáo dục sức khỏe y tế. + Tuyên truyền qua các phương tiện thông tin đại chúng

2.3. PHƯƠNG PHÁP THỐNG KÊ

Để mô tả đặc điểm lâm sàng và cận lâm sàng tôi sử dụng:

- Bảng phân bố tần suất các biến số định tính (các dấu hiệu lâm sàng như đồng tử trắng, lác…; các dấu hiệu siêu âm như vị trí u, kích thước u, xâm lấn củng mạc, bong võng mạc...; các dấu hiệu xét nghiệm hình ảnh học như CT, giải phẫu bệnh; các biến số khoảng khác như nhóm tuổi, phân độ REESE…).

- Trị số trung bình và độ lệch chuẩn của các biến số định lượng như tuổi xác định bệnh, tuổi bệnh nhi khi cha mẹ phát hiện triệu chứng đầu tiên.

Phép kiểm test để so sánh 2 tỉ lệ.

Phép kiểm χ2 , phân tích hồi qui logistic để xác định mối tương quan giữa các biến số (thí dụ: tương quan giữa sự biệt hóa nguyên bào võng mạc với thời gian xuất hiện bệnh; tương quan giữa bong võng mạc với xâm lấn dây thần kinh thị; …).

Tính độ nhạy, độ đặc hiệu, giá trị tiên đoán dương, giá trị tiên đoán âm của siêu âm và CT trong chẩn đoán xâm lấn UTNBVM dựa vào “tiêu chuẩn vàng” giải phẫu bệnh.

Các số liệu thống kê được trình bày với ước lượng điểm cùng với khoảng tin cậy 95%. Các phép kiểm với giá trị p < 0.05 được xem là có ý nghĩa thống kê.

Các phép kiểm trên được xử lý bằng phần mềm SPSS for Window 13.0.

- Qui trình thực hiện:

* Các biến số sau thu thập được ghi vào bệnh án nghiên cứu. * Mã hóa và nhập các biến số vào phần mềm SPSS 13.0. * Xử lý các phép kiểm.

2.4. Y ĐỨC TRONG NGHIÊN CỨU (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});

Vấn đề y đức trong nghiên cứu này là việc cắt bỏ nhãn cầu. Tất cả các bệnh nhi trong nghiên cứu này đều ở độ REESE 4 và REESE 5 có chỉ định cắt bỏ nhãn cầu. Có 1 trường hợp REESE 3 nhưng trong tình hình thực tiễn Việt Nam hiện nay khó có khả năng điều trị bảo tồn, nên chọn giải pháp cắt bỏ nhãn cầu để bảo tồn tính mạng bệnh nhi.

CHƯƠNG 3

KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU

3.1. KHẢO SÁT ĐẶC ĐIỂM LÂM SÀNG CỦA UTNBVM 3.1.1. DỊCH TỄ HỌC LÂM SÀNG 3.1.1. DỊCH TỄ HỌC LÂM SÀNG 3.1.1.1. Giới tính Bảng 3.2. Đặc điểm giới tính. Giới tính Số ca Tỉ lệ % NAM 33 57,54 NỮ 28 42,46 TỔNG 61 100

Nhận xét: Z = 1,17; p = 0,24 > 0,05. Tỉ lệ nam/nữ khác biệt không có ý nghĩa thống kê.

3.1.1.2.Tuổi bệnh nhi và tuổi cha mẹ

o Tuổi bệnh nhi lúc điều trị và lúc phát hiện bệnh

Bảng 3. 3. Tuổi bệnh nhi lúc điều trị.

Ngay sau sinh ≤ 12 th 13-24 th 25-36 th 37-48 th 49-60 th > 60 th TỔNG 0 ca 17 ca 21 ca 13 ca 5 ca 4 ca 1 ca 61 ca 0% 27,87 34,42 21,31 8,19 6,54 1,67 100%

Nhận xét: Tuổi trung bình là 23,64 ±17,63 tháng. Có 83,6% bệnh nhi < 48 tháng, không có ca được chẩn đoán bệnh ngay sau sinh.

Bảng 3. 4. Tuổi bệnh nhi lúc phát hiện bệnh (hầu hết do cha mẹ phát