chủng đã lựa chọn
Để đánh giá khả năng tạo màng của 10 chủng vi khuẩn đã phân lập và tuyển chọn, chúng tôi đã tiến hành thí nghiệm theo phƣơng pháp của O’Toole và cộng sự dựa trên nguyên lý về khả năng bắt giữ tím tinh thể của thành tế bào vi khuẩn (mục 2.2.4). Các chủng này đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MPA dịch trong điều kiện tĩnh, ở 30oC, sau 24 h màng sinh học đƣợc hình thành, chúng tôi tiến hành rửa màng bằng nƣớc cất cho sạch môi trƣờng nuôi cấy, và nhuộm màng bằng tím tinh thể kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.3
Hình 3. 3.Biofilm của 10 vi khuẩn tuyển chọn tạo thành sau 24 h nuôi cấy đƣợc nhuộm với dung dịch tím tinh thể 0,1%
Quan sát lƣợng tím tinh thể bám trên thành ống effendorf ở hình 3.3, chúng tôi nhận thấy khả năng bắt giữ tím tinh thể của biofilm do các chủng B11, B17, B21, B23, B24 tạo thành tốt hơn so với 5 chủng còn lại.
Phƣơng pháp nhuộm tím tinh thể giúp phát hiện ra các tế bào bám dính trong một biofilm trên bề mặt vật thể đồng thời cũng cho phép định lƣợng mức độ hình thành biofilm mạnh hay yếu trong một khoảng thời gian nhất định bằng phƣơng
39
pháp đo độ hấp thụ ánh sáng ở bƣớc sóng 570 nm (OD 570). Màng sinh học sau khi cố định đƣợc tím tinh thể, sẽ đƣợc hòa tan trong dung dịch axít acetic và pha loãng tới hạn rồi đo mật độ quang phổ ở bƣớc sóng 570 nm, kết quả đƣợc thể hiện ở hình 3.4 nhƣ sau:
Hình 3. 4. Đồ thị mật độ quang phổ đánh giá khả năng hình thành biofilm
Từ kết quả trên có thể thấy trong 10 chủng vi khuẩn đƣợc lựa chọn thì 5 chủng B11, B17, B21, B23, B24 đều có giá trị OD 570 khá cao từ 5,9 – 22,68. Trong đó, chủng B17 có khả năng hình thành biofilm mạnh nhất, tiếp đến là các chủng B11, B21 B23, và B24. Nhƣ vậy 5 chủng vi khuẩn này có khả năng sử dụng PAH cho quá trình sinh trƣởng và phát triển của chúng, đồng thời khả năng hình thành biofilm cao nhất. Vì vậy chúng tôi đã lựa chọn 5 chủng này là những chủng đại diện để tiến hành các nghiên cứu tiếp theo.
Năm chủng vi khuẩn này đã đƣợc tiến hành quan sát hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào dƣới kính hiển vi điện tử quét (Bảng 3.2) và phân loại dựa vào trình tự gen mã hóa 16S rRNA, chúng đã đƣợc định tên và đăng ký trên NCBI (Bảng 3.3).
40
Bảng 3. 2: Hình thái khuẩn lạc và hình thái tế bào của 5 chủng vi khuẩn đƣợc lựa
chọn
Thứ tự Ký hiệu Hình thái khuẩn lạc Hình thái tế bào
1 B11
2 B17
3 B21
4 B23
41
Bảng 3. 3: Kết quả phân loại và định tên của 5 chủng vi khuẩn lựa chọn
Thứ tự Ký hiệu chủng Tên phân loại Mã số trên NCBI
1 B11 Rhodococcus sp. B11 KC151262
2 B17 Rhodococcus sp. B17 JQ073891
3 B21 Pseudomonas sp. BQN21 KC151263
4 B23 Alcaligenes sp.BQN23 KC191600
5 B24 Pseudomonas sp. BQN24 KC178570