Làm giàu vi sinh vật
- Nguyên tắc:Tạo môi trƣờng thích hợp làm gia tăng số lƣợng vsv từ mẫu
thu thập ban đầu trên nguồn cơ chất quan tâm.
- Tiến hành:Hút 10 ml đối với mẫu nƣớc và 3g đối với mẫu bùn vào bình
tam giác thể tích 250 ml có chứa 50 ml môi trƣờng muối khoáng Gost dịch, 0,1% vitamin, 50 ppm hỗn hợp PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene) và 1 bình có bổ sung thêm 0,5% glucose. Nuôi lắc các bình ở 200 vòng/phút, ở 30oC, sau 7 ngày nuôi, chuyển 10% dịch làm giàu lần 1 sang bình nuôi cấy thứ 2 chứa các thành phần giống nhƣ ở lần làm giàu thứ nhất, quá trình nuôi cấy làm giàu đƣợc tiến hành 3 lần.
29
Phƣơng pháp pha loãng tới hạn
- Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng
rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân tích vi sinh vật.
- Tiến hành: Dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc
cất, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1, hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc cất ta sẽ đƣợc độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục nhƣ vậy đến nồng độ 10-8.
Tìm kiếm tập đoàn vsv và phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng sử PAH đƣợc tuyển chọn sau 3 lần làm giàu dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Nguyên tắc:
Thu đƣợc tập đoàn vsv có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH. Từ đó tách rời các tế bào vsv dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc để thu các chủng thuần.
Tiến hành:
- Môi trƣờng Gost sau khi khử trùng để nguội tới khoảng 50 - 60oC, tiến hành đổ vào các đĩa petri (đã tiệt trùng) trong box cấy vô trùng. Mỗi đĩa đổ khoảng 20 ml môi trƣờng.
- Sau khi thạch đông (đĩa khô), hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng tới hạn ở nồng độ 10-4, 10-6, 10-8 vào các đĩa thạch này, Gạt kiểm tra các mẫu sau khi làm giàu lần 1, lần 2 và lần 3.
- Dùng que trang trải đều mẫu khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng que này để trải đều khắp bề mặt thạch ở đĩa thứ 2, thứ 3.
- Các đĩa sau khi cấy gạt đƣợc bao gói cẩn thận và nuôi ở tủ ấm 30oC cho tới khi xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ.
30
2.2.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trƣởng tốt nhất trên môi trƣờng có chứa cơ chất PAH.
Nguyên lý:
Khi nuôi vsv trong môi trƣờng muối khoáng Gost nghèo dinh dƣỡng có bổ sung hỗn hợp PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene), vsv sẽ sử dụng PAH nhƣ là nguồn carbon và năng lƣợng duy nhất cho sự sinh trƣởng và phát triển của chúng. Sự phát triển của vsv đƣợc đánh giá định tính thông qua sự thay đổi độ đục của môi trƣờng nuôi cấy và lƣợng sinh khối bám trên thành bình.
Tiến hành:
- Nuôi qua đêm vsv trong môi trƣờng HKTS dịch để làm tƣơi mới chủng, ly tâm thu sinh khối, rửa sinh khối hai lần bằng nƣớc cất, hòa tan sinh khối, đo OD dịch sinh khối ở bƣớc sóng 600 nm, tính lƣợng sinh khối đầu vào cho 20 ml môi trƣờng bằng 0,3 khi đo OD ở bƣớc sóng 600 nm để khảo sát khả năng sử dụng PAH của chủng vi khuẩn.
- Bổ sung dịch sinh khối đã tính toán của mỗi chủng vào bình tam giác dung tích 100 ml, có chứa 20 ml Gost dịch, 0,1% vitamin, 50ppm PAH. Đem nuôi ở tủ lắc 30oC, ở 200 vòng/phút và quan sát sự thay đổi màu, lƣợng sinh khối bám trên thành bình trong quá trình nuôi khoảng 7 đến 9 ngày. Đo OD tại bƣớc sóng 600nm theo từng ngày để theo dõi sự sinh trƣởng và phát triển của chủng vi sinh vật trong môi trƣờng có chứa PAH.
- Chọn những chủng có khả năng phát triển tốt nhất ở nồng độ 50ppm để tiến hành nuôi ở điều kiện môi trƣờng có chứa nồng độ PAH cao hơn nhằm tìm kiếm những chủng có khả năng sử dụng PAH tốt nhất.