Sử dụng biofilm là một biện pháp xử lý ô nhiễm tƣơng đối mới ở Việt Nam. Năm 2009, Đỗ Khắc Uẩn và cs đã sử dụng thành công hệ thống màng lọc vật lý gồm các đơn nguyên màng vi lọc (kích thƣớc lỗ 0,22 µm) để xử lý nitơ, phốt pho và các chất hữu cơ trong nƣớc thải đô thị[12]. Phạm Thị Hồng Đức và Lê Văn Cát (2010) đã sử dụng màng lọc sinh học (biofilter) để loại bỏ nitơ trong hệ xử lý sinh học nhằm mục đích tái sử dụng nƣớc nuôi giống thủy sản [6]. Trong nghiên cứu gần đây, Lê Thị Nhi Công và cộng sự (2011) đã đánh giá khả năng tạo biofilm một số chủng vi khuẩn và nấm men phân huỷ dầu, phân lập từ các mẫu nƣớc biển bị ô nhiễm dầu ở Thanh Hoá và Vũng Tàu. Kết quả đã xác định đƣợc các chủng nhƣ Candida, Acinetobacter, Bacillus, Rhodococcus... là những chủng vừa tạo biofilm vừa có khả
năng phân huỷ và chuyển hoá các thành phần dầu mỏ rất tốt. Hơn thế nữa, sau 24 giờ nuôi cấy, ở dạng tạo biofilm chúng còn có khả năng phân huỷ dầu tốt hơn ở dạng tế bào planktonic[3]. Điều này cho thấy tiềm năng phong phú về chủng loại vi sinh vật vừa tạo biofilm vừa phân huỷ và chuyển hoá hydrocarbon trong các mẫu đất và nƣớc bị ô nhiễm dầu ở Việt Nam. Nhƣ vậy, nghiên cứu về biofilm sẽ mở ra khả năng ứng dụng vai trò của các vi sinh vật đối với các hệ sinh thái và đời sống con ngƣời.
26
Chƣơng 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. Nguyên liệu, hóa chất và các thiết bị sử dụng
2.1.1. Nguyên liệu
Mẫu nƣớc nhiễm dầu đƣợc lấy tại các cống thoát nƣớc tại Công ty xăng dầu B12 và dọc bờ biển cột 5 tới cột 8 TP. Hạ Long – Quảng Ninh; tại một số vùng ven biển Đồ Sơn, Hải Phòng; tại khu công nghiệp Nghi Sơn, Thanh Hóa. Mẫu đƣợc lƣu trữ ở Phòng Công nghệ sinh học Môi trƣờng, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và công nghệ Việt Nam trong vòng 24 h để phân tích.
2.1.2. Hóa chất, môi trƣờng nuôi cấy
Hóa chất
Các hóa chất đƣợc sử dụng trong nghiên cứu đều là hóa chất nhập ngoại của các hãng có uy tín trên thế giới nhƣ Sigma, Merk, Fermantas, Biobasic,.v.v.
Môi trƣờng nuôi cấy
Môi trƣờng nuôi cấy ở dạng lỏng (nuôi dịch) và dạng rắn (có bổ sung agar 18-20 g/l). Môi trƣờng trƣớc khi sử dụng đƣợc khử trùng ở 121oC (không có glucose) và ở 115oC (có glucose), 1 atm trong 30 phút. Bao gồm:
- Môi trƣờng hiếu khí tổng số (HKTS): Môi trƣờng nuôi cấy đặc trƣng cho nhóm vi khuẩn hiếu khí.
NH4NO3 2 (g/l) Glucose 1 (g/l)
KH2PO4 4 (g/l) Peptone 5 (g/l)
NaCl 5 (g/l) Cao men 0,2 (g/l)
KCl 0,25 (g/l) Cao thịt 3 (g/l)
MgCl2 1,25 (g/l) pH 7÷7,2
- Môi trƣờng Luria - Bertani (LB) dịch: Môi trƣờng để tách dòng gen 16S rRNA.
NaCl 5 (g/l) Cao men 5 (g/l)
27
- Môi trƣờng muối khoáng Gost: Môi trƣờng phân lập và kiểm tra khả năng phân hủy PAH.
Na2HPO4 0,7 (g/l) MgSO4 0,4 (g/l)
KH2PO4 0,3 (g/l) NaCl 1 (g/l)
KNO3 3 (g/l) pH 6,9 ÷ 7,2
- Môi trƣờng Meat-Peptone-Agar (MPA): Môi trƣờng kiểm tra khả năng tạo màng sinh học.
NaCl 5 (g/l) Cao thịt 3 (g/l)
Peptone 10 (g/l) pH 7 ÷ 7,2
-Nƣớc muối sinh lý (0,85% NaCl, w/v), dịch tím tinh thể (0,1%, w/v), dung dịch acetic acid 33% (v/v).
2.1.3. Máy móc và thiết bị nghiên cứu
Trong quá trình nghiên cứu, các thiết bị, máy móc đã đƣợc sử dụng có độ chính xác cao tại phòng thí nghiệm Công nghệ sinh học môi trƣờng và phòng thí nghiệm trọng điểm Quốc gia về công nghệ Gen - Viện Công nghệ sinh học (Bảng 2.1).
Bảng 2. 1: Máy móc và thiết bị dùng trong đề tài
Tên thiết bị Nhà sản xuất Nƣớc sản xuất
Bàn soi UV ECX-F15M VILBERLOURMAT Pháp
Bể điện di ELITE 300 PLUS WEALTEC Đài Loan
Bể ổn nhiệt ONE 29 MEMMERT Đức
Cân kỹ thuật BJ 610C PRECISA Thụy Sĩ
Kính hiển vi Eclipse LV-UDM NIKON Nhật Bản
Lò vi sóng NN-S215WF PANASONIC Trung Quốc Máy chuẩn pH-CyberScan pH 620 EUTECH Singapore Máy đo quang phổ UV-1601-220V SHIMADZU Nhật Bản
28
Máy ly tâm eppendorf 5417R HAMBURG Đức
Máy PCR VeritiTM Singapore
Máy voltex BR-2000 BIORAD Ustralia
Nồi hấp tiệt trùng MC – 30L ALP Nhật Bản
Tủ ấm và tủ lắc nuôi cấy NB205QF N – Biotek Hàn Quốc
Tủ cấy vô trùng AVC-4A1 ESCO Singapore
Tủ lạnh sâu -80oC MDF-192 SANYO Nhật Bản
Tủ lạnh SJ-169S-DS SHARP Thái Lan
Tủ sấy dụng cụ JSOF – 100 JSR Hàn Quốc
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu 2.2.1. Thu thập mẫu 2.2.1. Thu thập mẫu
Mẫu nƣớc nhiễm dầu đƣợc lấy tại Công ty xăng dầu B12 và dọc bờ biển cột 5 tới cột 8 TP. Hạ Long – Quảng Ninh; tại một số vùng ven biển Đồ Sơn, Hải Phòng; tại khu công nghiệp Nghi Sơn, Thanh Hóa, mẫu đƣợc lấy ở 2 vị trí: tầng nƣớc mặt và tầng bùn đáy. Mẫu lấy về đƣợc phân tích ngay trong vòng 24h lấy mẫu và đƣợc bảo quản ở tủ lạnh 4oC tại phòng Công nghệ sinh học môi trƣờng, Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học và Công nghệ Việt Nam, đảm bảo tính chất và thành phần mẫu không bị thay đổi để phục vụ các nghiên cứu tiếp theo.
2.2.2. Phân lập các chủng vi khuẩn có khả năng sử dụng PAH
Làm giàu vi sinh vật
- Nguyên tắc:Tạo môi trƣờng thích hợp làm gia tăng số lƣợng vsv từ mẫu
thu thập ban đầu trên nguồn cơ chất quan tâm.
- Tiến hành:Hút 10 ml đối với mẫu nƣớc và 3g đối với mẫu bùn vào bình
tam giác thể tích 250 ml có chứa 50 ml môi trƣờng muối khoáng Gost dịch, 0,1% vitamin, 50 ppm hỗn hợp PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene) và 1 bình có bổ sung thêm 0,5% glucose. Nuôi lắc các bình ở 200 vòng/phút, ở 30oC, sau 7 ngày nuôi, chuyển 10% dịch làm giàu lần 1 sang bình nuôi cấy thứ 2 chứa các thành phần giống nhƣ ở lần làm giàu thứ nhất, quá trình nuôi cấy làm giàu đƣợc tiến hành 3 lần.
29
Phƣơng pháp pha loãng tới hạn
- Nguyên tắc: Pha loãng mẫu là một trong những công đoạn cơ bản nhƣng
rất quan trọng trong quá trình phân tích vi sinh vật. Việc pha loãng mẫu ở các nồng độ thích hợp sẽ giúp ích rất nhiều trong quá trình định lƣợng cũng nhƣ phân tích vi sinh vật.
- Tiến hành: Dùng pipet hút 1 ml mẫu cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc
cất, khi đó ta sẽ đƣợc nồng độ pha loãng là 10-1. Tiếp tục từ ống nghiệm 10-1, hút tiếp 1 ml và cho vào ống nghiệm chứa 9 ml nƣớc cất ta sẽ đƣợc độ pha loãng 10-2
. Tiếp tục nhƣ vậy đến nồng độ 10-8.
Tìm kiếm tập đoàn vsv và phân lập một số chủng vi khuẩn có khả năng sử PAH đƣợc tuyển chọn sau 3 lần làm giàu dựa vào đặc điểm hình thái khuẩn lạc
Nguyên tắc:
Thu đƣợc tập đoàn vsv có khả năng phát triển trên môi trƣờng chứa PAH. Từ đó tách rời các tế bào vsv dựa vào hình thái và màu sắc khuẩn lạc để thu các chủng thuần.
Tiến hành:
- Môi trƣờng Gost sau khi khử trùng để nguội tới khoảng 50 - 60oC, tiến hành đổ vào các đĩa petri (đã tiệt trùng) trong box cấy vô trùng. Mỗi đĩa đổ khoảng 20 ml môi trƣờng.
- Sau khi thạch đông (đĩa khô), hút 0,1 ml dịch mẫu đã pha loãng tới hạn ở nồng độ 10-4, 10-6, 10-8 vào các đĩa thạch này, Gạt kiểm tra các mẫu sau khi làm giàu lần 1, lần 2 và lần 3.
- Dùng que trang trải đều mẫu khắp bề mặt thạch, tiếp tục sử dụng que này để trải đều khắp bề mặt thạch ở đĩa thứ 2, thứ 3.
- Các đĩa sau khi cấy gạt đƣợc bao gói cẩn thận và nuôi ở tủ ấm 30oC cho tới khi xuất hiện các khuẩn lạc riêng rẽ.
30
2.2.3. Tuyển chọn các chủng vi khuẩn có khả năng sinh trƣởng tốt nhất trên môi trƣờng có chứa cơ chất PAH.
Nguyên lý:
Khi nuôi vsv trong môi trƣờng muối khoáng Gost nghèo dinh dƣỡng có bổ sung hỗn hợp PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene), vsv sẽ sử dụng PAH nhƣ là nguồn carbon và năng lƣợng duy nhất cho sự sinh trƣởng và phát triển của chúng. Sự phát triển của vsv đƣợc đánh giá định tính thông qua sự thay đổi độ đục của môi trƣờng nuôi cấy và lƣợng sinh khối bám trên thành bình.
Tiến hành:
- Nuôi qua đêm vsv trong môi trƣờng HKTS dịch để làm tƣơi mới chủng, ly tâm thu sinh khối, rửa sinh khối hai lần bằng nƣớc cất, hòa tan sinh khối, đo OD dịch sinh khối ở bƣớc sóng 600 nm, tính lƣợng sinh khối đầu vào cho 20 ml môi trƣờng bằng 0,3 khi đo OD ở bƣớc sóng 600 nm để khảo sát khả năng sử dụng PAH của chủng vi khuẩn.
- Bổ sung dịch sinh khối đã tính toán của mỗi chủng vào bình tam giác dung tích 100 ml, có chứa 20 ml Gost dịch, 0,1% vitamin, 50ppm PAH. Đem nuôi ở tủ lắc 30oC, ở 200 vòng/phút và quan sát sự thay đổi màu, lƣợng sinh khối bám trên thành bình trong quá trình nuôi khoảng 7 đến 9 ngày. Đo OD tại bƣớc sóng 600nm theo từng ngày để theo dõi sự sinh trƣởng và phát triển của chủng vi sinh vật trong môi trƣờng có chứa PAH.
- Chọn những chủng có khả năng phát triển tốt nhất ở nồng độ 50ppm để tiến hành nuôi ở điều kiện môi trƣờng có chứa nồng độ PAH cao hơn nhằm tìm kiếm những chủng có khả năng sử dụng PAH tốt nhất.
2.2.4. Đánh giá khả năng tạo màng sinh học của các chủng vi khuẩn
Tiến hành theo phƣơng pháp của O’Toole và Kolter (1998); Morikawa và cộng sự (2006). [33, 35]
Làm tƣơi mới chủng tạo biofilm:
Các chủng vi khuẩn đƣợc nuôi cấy trên môi trƣờng MPA dịch. Sau 14 - 16 h nuôi cấy, đem ly tâm loại dịch, thu sinh khối (ly tâm 3 lần ở 4.000 rpm, 4oC trong
31
vòng 10 phút và rửa nƣớc cất 2 lần với thể tích tƣơng ứng). Bổ sung nƣớc cất sau lần ly tâm cuối cùng và đánh tan sinh khối. Tiến hành pha loãng tới hạn và đo OD ở bƣớc sóng 600 nm, pha loãng dịch sinh khối bằng nƣớc cất để đạt OD là 0,3. Bổ sung 1% dịch này vào các eppendorf chứa 297 μl môi trƣờng MPA. Bố trí thí nghiệm lặp lại 3 lần và theo dõi trong 3 ngày. Các mẫu đƣợc nuôi ở tủ ấm 30oC và đánh giá khả năng tạo biofilm sau 24, 48 và 72 h.
Kiểm tra khả năng tạo biofilm của chủng vi khuẩn
Nguyên lý:
Thành tế bào vi khuẩn trong biofilm có khả năng bắt giữ tím tinh thể sau khi nhuộm cố định ở nhiệt độ phòng. Khi bổ sung dung dịch axít acetic 33% sau nhuộm có tác dụng loại bỏ tím tinh thể ra khỏi thành tế bào vi khuẩn, lúc này các tím tinh thể sẽ đƣợc giải phóng và hòa tan trong dung môi. Giá trị OD ở bƣớc sóng 570 nm thể hiện độ hấp thụ ánh sáng của dung dịch tím tinh thể và tỷ lệ với lƣợng tím tinh thể đƣợc cố định, tức đặc trƣng cho mật độ tế bào trong cấu trúc biofilm hay nói cách là khả năng tạo màng sinh học của chủng vi khuẩn tƣơng ứng.
Tiến hành:
Cứ sau 24 h lấy các eppendorf chứa mẫu nuôi, mỗi chủng tƣơng ứng với 3 eppendorf cho mỗi ngày và tiến hành kiểm tra khả năng tạo biofilm theo các bƣớc sau:
- Dùng pipet hút dịch nuôi cấy ra 1 cách nhẹ nhàng (không làm vỡ màng) - Rửa nhẹ nhàng màng sinh học bằng 500 μl nƣớc cất. Quá trình này đƣợc lặp lại 2 lần.
- Cho 300 μl dung dịch tím tinh thể 0,1% vào các eppendorf ở nhiệt độ phòng
- Đợi 10 phút để cố định màng - Hút bỏ dung dịch tím tinh thể - Rửa bằng 500 μl nƣớc cất, 2 lần
- Bổ sung 300 μl dung dịch acetic acid 33%
32
2.2.5. Nghiên cứu ảnh hƣởng của một số điều kiện hóa lý và nồng độ cũng nhƣ loại PAH đến khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn loại PAH đến khả năng sinh trƣởng của các chủng vi khuẩn lựa chọn
- Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ: Tiến hành nhƣ mục 2.2.3 ở các nhiệt độ 20 oC, 28 oC, 30 oC, 37 oC,45oC
- Khảo sát ảnh hƣởng của pH: Chuẩn bị môi trƣờng Gost với các dải pH, sử dụng dải pH: 6, 7, 8, 9, 10. Sử dụng hỗn hợp 50 ppm PAH (naphthalene, fluorene, anthracene, pyrene). Tiến hành nhƣ mục 2.2.3
- Khảo sát ảnh hƣởng của muối NaCl: Chuẩn bị môi trƣờng Gost có bổ sung các nồng độ NaCl khác nhau: 0 %, 1%, 1,5 %, 2 % và tiến hành nhƣ mục 2.2.3
- Khảo sát ảnh hƣởng của nồng độ và loại PAH khác nhau: tiến hành nhƣ mục 2.2.3 nhƣng sử dụng các PAH ở các nồng độ khác nhau
2.2.6. Đánh giá khả năng phân hủy PAH của màng sinh học (biofilm) do các chủng vi khuẩn lựa chọn tạo thành chủng vi khuẩn lựa chọn tạo thành
2.2.6.1. Quy trình tạo biofilm đa chủng
Bƣớc 1: Từ các chủng vi khuẩn lựa chọn sinh khối của chúng đƣợc nhân lên trong 50 ml môi trƣờng LB dịch trên máy lắc với tốc độ 180 vòng/phút ở 30 oC trong 24 giờ.
Bƣớc 2: Sau 24 giờ, ly tâm với tốc độ 4000 vòng/phút/4 oC trong 10 phút để thu sinh khối. Rửa bằng nƣớc cất 2 lần.
Bƣớc 3: Hòa tan sinh khối bằng nƣớc cất, đo OD ở bƣớc song 600nm và tính toán sao cho OD600 = 0,3. Bổ sung 4,5 lít môi trƣờng LB dịch vào bình trụ thủy tinh.
Bƣớc 4: Để tĩnh trong 24 giờ sao cho trên bề mặt bình thủy tinh xuất hiện lớp màng vi sinh vật.
Bƣớc 5: Dùng pipet hút nhẹ dịch ở dƣới màng và rửa sạch màng bằng nƣớc cất 2 lần.
Bƣớc 6: Bổ sung 5 lít Gost dịch, bổ sung 0,5% glucose; 0,1% vitamin tùy vào mục đích xử lý mà bổ sung nguồn cơ chất thích hợp nhƣ: dầu FO,nƣớc thải ô
33
nhiễm dầu hoặc các loại PAH. Bƣớc 7: Nuôi tĩnh 9-14 ngày mang mẫu đi phân tích để đánh giá hiệu quả xử lý các thành phần trên.
2.2.6.2. Đánh giá khả năng phân hủy các thành phần hydrocacbon thơm bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ. bằng phƣơng pháp sắc ký khí khối phổ.
Qui trình chuẩn bị mẫu để phân tích PAH trong nƣớc trên cơ sở phƣơng pháp US EPA method 610
- Lấy 60 ml CH2Cl2 cho vào 500ml mẫu nƣớc đựng trong phễu chiết, lắc đều, để lắng chờ hỗn hợp tách thành hai pha. Tách pha CH2Cl2 (bên dƣới) ra.
- Tiếp tục thêm 60 ml CH2Cl2 vào pha nƣớc, làm tƣơng tự nhƣ trên. (chiết 3 lần)
- Gom toàn bộ dịch chiết CH2Cl2, làm khan bằng Na2SO4, lọc, cô quay dung môi dƣới áp suất giảm đến khi còn 10 ml.
- Cho dịch chiết này qua cột chiết pha rắn florisil, rửa giải bằng 3ml n-hexan - Hút 1ml dịch n-hexan đi phân tích GC/MS. Bơm 0.2µl mẫu vào máy GC/MS
Máy phân tích thuộc hệ GC/MS Agilent 6980-5973N. Cột sử dụng phân tích là HP-5MS. Chƣơng trình nhiệt độ 50 - (3/ph) - 80- (8/ph) - 200 (15/ph) - 250 (7ph).
Nguyên lý hoạt động của máy GC-MS:
Các Mẫu đƣợc đƣợc bơm vào cổng bơm sau đó đƣợc đƣa đến buồng hoá khí (Mẫu lỏng hoá thành dạng khí dƣới áp suất thấp (10-4
– 10-7mmHg) nhờ bơm hút chân không. Dựa trên sự phân bố liên tục các cấu tử chất phân tích lên hai pha: một pha thƣờng đứng yên(chất tẩm bên trong cột), có khả năng hấp thu chất phân tích gọi là pha tĩnh, một pha di chuyển qua pha tĩnh(khí mang, Helium) gọi là pha động. do các cấu tử chất phân tích có ái lực khác nhau với pha tĩnh, chúng di chuyển với tốc độ khác nhau và tách ra khỏi nhau.Sau khi các cấu tử tách ra khỏi nhau sẽ lần lƣợt đi vào buồng ion hóa qua một lỗ nhỏ có đƣờng kính 0,013 – 0,05mm (bằng vàng), dòng phân tử khí của mẫu va chạm với dòng electron mang năng lƣợng cao làm các phân tử mẫu trung hoà bị bật ra các electron và phá vỡ phân tử thành các
34
mảnh ion dƣơng, mảnh gốc hay phân tử trung hoà nhỏ. Các mảnh ion hình thành có